海带种质固相保存技术,本文是保存类有关学年毕业论文范文与种质和海带和固相有关本科毕业论文范文.
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摘 要：将海带种质的无菌采集与配子体固相保存相结合,对种海带的处理、游孢子的采集、配子体的分离与固相接种等关键步骤进行了研究和改进,建立了一种高效的海带配子体固相保存方法,此方法从源头降低了细菌的污染,减少了配子体保存过程中污染细菌的机会,简化了常规固相保存的菌处理流程,提高了保种效率,有利于固相保存方法的大规模应用.
关键词：海带；配子体；固相保存；无菌采集
海带（Saccharina japonica）属于褐藻门（Phaeophyta）、海带目（Laminariales）、海带科（Laminariaceae）、海带属（Saccharina）,为大型经济海藻,19世纪20年代从日本首次引进,并逐渐适应中国海域条件,现在是中国人工栽培历史最长、产量最高的大型经济海藻,在医药、食品、化工等方面都有广泛的应用[1-5].20世纪70年代建立了海带配子体的采集和培养技术,为海带的种质保存奠定了基础[6-8].利用传统方法采集的配子体一般要分离到试管中并用棉花塞封口保存,通常每月更换一次培养液,工作量大,操作繁琐,增加了细菌污染和种质丢失、混杂的机会[9]；2005年山东东方海洋科技股份有限公司和烟台大学合作开发了海带配子体固相保存技术[10],但由于实验室原有配子体克隆保存时间的延长、外界环境及海区水质的变化[11-15]及液相培养开放性操作等诸多因素的影响,至2008年底保存的海带配子体克隆多有细菌污染,部分甚至出现真菌,并且污染菌的组成复杂,不是单一的一种菌[16].采用常规的固相培养方法,前期处理海带配子体所附带细菌的流程比较复杂,同时处理污染较重的海带雌雄配子体克隆,海带雌雄配子体克隆往往很难达到无菌状态,接种后极易长菌,导致固相培养失败；超声波粉碎对海带配子体的状态也有不可逆的负作用[17,18]；这些方面都影响了常规固相保存技术的推广应用.为了促进海带配子体固相保存技术的应用,本研究针对以上问题,从种质采集源头出发,建立了一种种质无菌采集与固相培养相结合的方法,有效地解决了上述问题,为固相保存的大规模应用奠定了基础.
1材料和方法
1.1实验材料
在山东东方海洋科技股份有限公司实验海区选取性状优良、成熟度好、孢子囊区突出明显的种海带运回实验室,进行种质采集.
1.2实验方法
1.2.1孢子囊海带块的无菌处理在海带孢子囊区剪取2 cm×3 cm左右的长条,利用冷却的煮沸海水和灭菌脱脂棉反复擦拭,去除藻体上所附着的杂藻、附泥及黏液.在无菌室外间,用高压灭菌的冷却海水和灭菌脱脂棉再次擦拭后,移入无菌室超净工作台内,首先利用含有100 mg/L的阿奇霉素和100 mg/L的环丙沙星的双抗无菌海水浸泡20 min,再利用含有1.5% 碘化钾的无菌海水浸泡10 min,抽滤海水浸泡5 min,重复一次抽滤海水浸泡5 min.
1.2.2海带游孢子的放散、附着及萌发将无菌处理的海带块直接放入蓝盖血清瓶,加抽滤的高压灭菌的冷却海水进行孢子放散.取6～8滴海带孢子水在显微镜下观察,查看海带游孢子的活力和数量,海带游孢子密度每视野（160倍镜下）达5个左右时,移出海带块,停止放散.使用300目筛绢过滤海带孢子液中的黏液及杂质,将海带孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中进行海带孢子体的附着、萌发.培养条件：光照强度1 200～1 500 lx,24 h光照,温度10～12 ℃,待48 h海带孢子体附着牢靠后,更换染色缸中的抽滤的高压灭菌的冷却海水,5～7 d镜检一次.在显微镜下,海带孢子体转化为海带配子体雌雄可辨时,即可挑取分离海带雌雄配子体.
1.2.3固相保存培养基的配制配制PESI固体培养基,每100 mL的PESI液体培养基中添加0.6～0.8 g琼脂粉,使用立式压力蒸汽灭菌器灭菌,在121 ℃,0.1 MPa,30 min条件下高温灭菌；PESI固体培养基高温灭菌后冷却至60 ℃后分别添加阿奇霉素、利福平、制霉菌素,使PESI固体培养中的阿奇霉素浓度为10 mg/L、利福平浓度为10 mg/L、制霉菌素浓度为10 mg/L（即抗生素的最终浓度）,混匀后用9 cm直径的培养皿倒平板,冷凝备用.
1.2.4海带配子体的分离与接种在超净工作台内的显微镜下,从事先备好的附有海带配子体的载玻片上挑取状态优良、特征明显的配子体；利用毛细玻璃管将挑取的海带配子体先移到盖玻片上,镜检确保是一个雌配子体或是一个雄配子体后,再利用毛细管重新吸入植入固体培养基中,完成此操作后需要镜检盖玻片和毛细玻管,看是否有海带配子体残留,每个PESI固体培养板接10～15个海带配子体,接种后利用parafilm封口膜密封.
1.2.5固相保存的培养将接种的PESI固体培养板放入光照培养箱中培养,24 h光照,光强1 200～1 500 lx ,10 ℃左右,保存2个月左右,可见培养基中长出的海带配子体克隆系藻斑10～15 mm,肉眼可见,此时将其转入暗光低温冷藏柜中保存（光照强度0～100 lx,4 ℃左右）,使海带配子体细胞进入休眠状态,进行长期保存,根据培养基表面干燥程度添加灭菌的PESI培养液（一般是一年添加一次灭菌的PESI培养液）.
2结果与分析
2.1海带配子体的分离及固相保存
本实验中海带配子体附着培养35 d左右挑取分离雌雄配子体（图1a,图2a、2d）,利用毛细玻璃管接种到0.8%的PESI固体培养基中,培养90 d左右,长出1.0～1.5 mm的藻斑（图1b）.
2.2固相保存海带配子体的复苏
用灭菌牙签从PESI固体培养板上挑取肉眼可见的海带配子体克隆系藻斑（图2b、2e）,接种于灭菌的PESI培养液中,温度8～12 ℃,光照强度1 000～1 500 lx,24 h光照条件下培养50～60 d即可长成簇状的海带配子体克隆系（图2c、2f）.
2.3固相保存配子体克隆系的无菌检测
即固相保存海带配子体克隆系是否为细菌或真菌污染的检测：在超净工作台中按表1设置检验,28 ℃摇菌培养3 d,看培养液是否有菌污染.
进行配子体保存以及其后所进行的固相保存海带配子体的复苏过程是否会造成海带配子体为细菌和真菌所污染,采用摇菌的方法进行初步判定.实验设计见表1,检测方法是设置阳性和阴性对照,阳性对照即为已分别接种污染有细菌的配子体的液体培养基—2216E培养液和已接种污染有真菌的配子体的液体培养基—沙堡培养液,阳性对照28 ℃在摇床中摇菌,培养液会变浑浊；阴性对照即为未添加任何污染物的细菌培养液---2216E培养液和真菌培养液—沙堡培养液,阴性对照28 ℃在摇床中摇菌,正常操作下培养液是澄清的；将被检测物分别加入细菌培养液和真菌培养液中,和阳性、阴性对照在相同条件下摇菌,看浑浊或澄清状况来判断是否为细菌或真菌污染,在此实验中被检测物为雌性海带配子体♀、雄性海带配子体♂复苏培养液,如果摇菌结果浑浊表明海带配子体有菌污染,如果摇菌结果澄清表明海带配子体无菌污染[19-22].检测实验结果见图3,结果显示,利用固相保存方法复苏的配子体未污染细菌和真菌,无菌效果良好.
3讨论
3.1接种前配子体处理方式
常规固相保存需要采用超声波多次粉碎液体培养的配子体克隆簇状体,将配子体克隆粉碎为1～4个细胞,超声波在粉碎处理时,对配子体的机械损伤很严重,即使粉碎的同时对样品进行冰浴,但样品内部升温也很快且高,对配子体克隆也会造成很大的损伤,短时间内配子体克隆状态难恢复；超声波粉碎后形成的细胞混液中克隆段大小难控制,配子体克隆上的附菌被打落进入悬液也很难清除,接种固相培养基时更易造成污染；超声波粉碎仪刀头清理不当也易造成种间污染；新固相保存方法不需经超声波粉碎,而是通过采集种质的载玻片进行分离单个的雌雄配子体,当载玻片上附着的孢子萌发为配子体,经10 d培养,雌雄可辨且每个配子体长到含有十个细胞左右,使用毛细玻璃管转入固相培养基,对克隆零损伤,也不会带入过多的培养液造成培养基的污染.
3.2实验中抗生素的选择和添加
3.2.1孢子囊海带块的双抗海水处理常规处理孢子囊海带块的双抗药物是链霉素和青霉素组合,但是本实验所采用的阿奇霉素和环丙沙星双抗组合,是微生物实验室通过近5年来实验室人员出海收集的全国各地海区的海带样品,刮取其表面附菌,分离纯化菌种,药敏实验,最低抑菌浓度实验,生物学统计,最终得出结论：阿奇霉素和环丙沙星对95%以上的配子体污染菌都有效（多为高敏或极高敏）；经最低抑菌浓度实验和反复验证100 mg/L阿奇霉素和100 mg/L环丙沙星效果最好[23-25].
3.2.2固相培养基中添加的抗生素常规的固相保存需要通过对保存的配子体克隆进行药敏实验确定固相培养基中添加抗生素的种类,保存一个配子体就需要做一次药敏,工作很繁琐；而此种固相保存培养基中添加的抗生素种类的确定是通过近5年来对每一批新采集的海带配子体进行跟踪药敏实验,对数据进行归纳统计总结出对98%的新采集来的海带配子体附菌均有效的抗生素药物是阿奇霉素和利福平[23]；同时对污染的真菌也进行了分离纯化,药敏实验,现有11种常用真菌抗生素,制霉菌素和特比萘芬效果较好[23]；为了防止周围环境中的真菌尤其是夏天培养箱潮湿环境中的真菌污染,在培养基中添加制霉菌素；采用此种方法无须每个样品都需要做药敏,大大节省了固相前处理的一系列预备工作.
3.3接种工具和接种方式
常规固相操作中,配子体的接种是在超净工作台中,用10 mL的一次性无菌注射器取2 mL粉碎的配子体细胞悬液,逐点注射入一个平板内,带有菌的培养液也被转入固相培养基中,不但易造成污染,并且一个平板内只保存了一个克隆系,保存的量有限；新固相保存操作中配子体的接种是在超净工作台中的显微镜下,从附有海带配子体的载玻片上挑取性状优良、特征明显的海带配子体克隆,使用内径约为200 μm的毛细玻璃管针吸出符合要求的配子体,先转移到灭菌的盖玻片上,镜检保证是符合要求的那个配子体,并且只有一个配子体后,再重新使用毛细玻璃管吸入并植入固相培养基的表层,此操作完成后再镜检一下盖玻片和毛细玻璃管针,看是否有配子体克隆残留,没有残留则完成海带配子体的接种；不会带入过多的培养液造成培养基的污染,一个平板可以保存多个配子体,每一个配子体长成将成为一个克隆系,也就是一个平板能保存多个克隆系,更大地节省了空间.
3.4PESI固体培养基中琼脂的浓度
本方法中接种工具和接种方式是使用内径约为200 μm的毛细玻璃管针,固相培养基硬的话很易折断针头,不利于配子体克隆的接种及挑取；同时含有十几个细胞的配子体在固相培养基中的生长对湿润环境要求更严格,经反复试验确定06%～0.8% 琼脂浓度使固相培养基更软弹,固相培养基水分保持较好,更有利于接种配子体的成活.此配方中节省了琼脂粉的使用量,降低了成本.
4结论
本研究将海带配子体的无菌采集和固相保存结合起来,即对种海带进行擦洗,并立即进行无菌采克隆,待海带游孢子附着萌发转为海带配子体,当海带配子体大小适中,密度均匀,雌雄可辨时,分离单个配子体并进行固相保存.具有如下优点：节省空间,利用现有方法试管保存新分离的配子体克隆,占用光照培养箱较大面积,而固相保存,可大大节省空间面积,并且没有试管液体保存出现的皮筋老化,试管液体倒、洒等问题.比液相保存更省时省力,保存可长达三年,不用添加培养基或更换培养基,而液相培养一般一个月更换一次培养液,并且操作比较开放,种质污染、混杂机会增加,同时倾倒培养液的过程也是散播污染菌的过程,也会造成不同种污染菌之间的交叉污染.将海带配子体的无菌采集和固相保存结合起来,通过无菌采集海带配子体,在源头就抑制细菌的污染,降低了海带配子体污染细菌的机会,也大大简化了海带配子体固相保存前期的无菌处理流程,降低固相培养前期处理海带配子体所附带细菌的难度.现有方法液相保存有可能会造成种质本身的老化,固相保存可使克隆进入休眠状态,减缓海带配子体克隆的新陈代谢,延长保存时间,便于固相保存方法的推广应用.
参考文献：
[1]
李宏基.中国海带养殖若干问题[M].北京:海洋出版社,1996:3-14
[2] Tseng C K.Algal biotechnology industries and research activities in China[J].Journal of Applied Phycology ,2001,13:375-380
[3] 金振辉,刘岩,张静,等.中国海带养殖现状与发展趋势[J].海洋湖沼通报,2009(1): 141-150
[4] 王文亮,王守经,宋康,等.海带的功能及其开发利用研究[J].中国食物与营养,2008(8):26-27
[5] 刘树立,王春艳,王华,等.我国海带的加工利用和开发[J].食品与药品,2007(5):208-209
[6] 张全胜,罗世菊.海带种质保存技术的研究现状和发展前景[J].水产科技情报,2006,33(2):61-63
[7] 张全胜.海带种质保存技术[J].中国水产,2005(9):64-65
[8] 杨官品,李晓捷,丛义周,等.海带配子体无性繁殖（克隆）技术研究与应用进展[J].中国海洋大学学报:自然科学版,2007,37(4):569-572
[9] 张壮志,钱瑞,罗世菊,等.海带种质保存防污染技术[J].河北渔业,2010(5):30-31
[10] 唐永政,张全胜,张壮志,等.海带配子体固相培养保存方法:中国,ZL 2005 1 0123272.1[P].2007-08-29
[11] 徐家伟,郑学林.海洋环境污染现状分析[J].绿色科技,2015(3):208-209
[12] 张田浩,王飞.海洋环境污染现状及对渔业的影响[J].安徽农业科学,2014(12):3654-3655
[13] 蒋慧,谭映宇,贾青.中国沿海地区经济增长与海洋环境污染现状分析研究[J].环境科学与管理,2015,40(4):17-19
[14] 杨林林,姜亚洲,程家骅.中国海洋渔业水域环境研究现状及展望[J].生物学杂志,2011,28(1):74-78
[15] 毕建国,段志霞.我国海洋渔业生态环境污染及治理对策[J].中国渔业经济,2008,26(2):16-21
[16] 王娜,钱冠兰,李晓捷,等.海带配子体克隆中一株镰刀菌的分离鉴定[J].微生物学通报,2010(9):1-4
[17] 刘涛,朱明壮,包振民,等.超声波对海带配子体克隆的作用[J].海洋湖沼通报,2000(4):39-44
[18] 路德明,张中南,夏羽中.超声波对盐藻的破碎作用[J].青岛海洋大学学报:自然科学报,1992(3):18-22
[19] 张晖,黄萍.微生物学实验室菌种使用、保存与管理方法研究[J].公共卫生与预防医学,2008,19(4):93-95
[20] 安瑛琳,郭恒峻,王芳,等.普通微生物学实验用菌种保藏方法的探讨[J].实验室科学,2009(1):97-99
[21] 方丽,王连平,茹水江,等.植物组培过程中污染微生物种类及其季节性的变化[J].浙江农业学报,2013,25(2):284-287
[22] 周俊辉,方焕谋.植物组织培养中污染的鉴定与防止初步研究[J].微生物学杂志,2002 ,22(2):53-55
[23] 金光,王娜,李言,等.海带配子体污染菌的来源分析及其抗生素抑菌试验[G].中国藻类学会第八次会员代表大会就暨十六次学术讨论会论文摘 要集,2013-11-11
[24] 赛珊,赵楠,武瑞娜,等.青霉素在海带配子体培养中的作用初探[J].南方农业,2015,9(12):128-129
[25] 赵聚萍,高滨,王娜,等.大型海藻种质保存中污染的丝状真菌菌群和药敏分析[J].生物技术世界,2015,12(2):183
（收稿日期：2016-12-28）
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