组蛋白乙酰化对衰老雌鼠胚胎发育影响,本文是蛋白类硕士论文开题报告范文跟胚胎发育和衰老和蛋白有关论文写作技巧范文.
蛋白论文参考文献：
1前言
随着晚婚晚育政策的推行以及“二胎政策”的放开,生殖健康越来越成为人们关注的焦点.衰老的卵子会带来包括流产在内的一系列问题,通过对衰老卵子影响因素的研究,我们可以更好地对卵子质量进行调控,提高生殖健康能力.
为进一步探索与卵母细胞质量相关的年龄的相关因素,我们在实验室比较了年轻C57BL/6雌鼠（5周）与45周雌鼠的MII卵母细胞的mRNA的各个基因表达量.通过转录组测序发现,接近5%的母源物质受到了年龄增长的影响.有趣的是,有很多与表观修饰相关的转录本受到了年龄增长的严重影响,例如DNA化转移酶、组蛋白乙酰化酶等.
我们的研究是通过比较不同年龄雌鼠的受精胚胎的发育能力发现衰老雌鼠的生殖能力出现明显下降,并出现流产、妊娠率低等现象.该研究通过在体内和体外模拟方式明确了乙酰化升高是卵母细胞衰老造成动物流产、妊娠率低的一个重要原因,并且乙酰化的升高改变了众多基因的表达,从而为人们提高对卵母细胞衰老认识、进行胚胎质量控制提供重要的证据.
2方法
2.1CD-1雌鼠受精卵的获取
我们选取了8~10周龄的CD-1雌鼠获取受精卵和实验用卵母细胞.
2.2体外TSA处理
通过对实验受体分别做添加去乙酰化酶抑制剂TSA,和不加TSA处理,放入胚胎培养箱观察发育.囊胚后移植至假孕体内观察体内发育.
2.3假孕雌鼠的制备
挑选健康8周龄左右性成熟雌性CD-1品系雌鼠,与同品系输精管结扎公鼠合笼交配.之后通过检栓,挑选出假孕雌鼠.
2.4雌鼠胚胎移植
对雌鼠进行全身麻醉后,将要移植的囊胚注入假孕鼠输卵管膨大部中.
2.5免疫荧光染色
将要染色的胚胎,按流程进行清洗、染色.
2.2.6PCR检测
按配方进行PCR鉴定.
3数据分析
3.1衰老雌鼠生殖能力下降
3.1.1衰老雌鼠受精卵质量差
我们选取6周和14个月大的CD-1雌鼠作为研究对象.通过超数排卵的手段对两种雌性雌鼠进行激素调节,随后在注射完HCG后,将超数排卵的雌鼠与雄鼠进行合笼,利用输卵管冲洗的办法取出受精卵.通过在高倍光镜下检测,我们发现衰老雌鼠的受精卵胞质发黑,并呈颗粒化.该结果说明受精卵的质量随着雌鼠年龄的增长而变差.
3.1.2衰老雌鼠早期胚胎发育效率低下
我们分别取年轻雌鼠（8周）和衰老雌鼠（14月）的受精卵进行体外培养观察.我们发现衰老雌鼠的胚胎发育率随着细胞分裂次数的增多,逐渐下降（图3-1）.囊胚率约为年轻雌鼠的一半.该结果表明随着雌鼠年龄的增长,雌鼠早期胚胎发育能力下降.
3.1.3衰老雌鼠胚胎具有妊娠率低并出现胎儿流产畸形的特点
为了更好地排除衰老个体对胚胎发育的影响,我们所选取的假孕均为同一周龄,即均为8周雌鼠.我们分别向假孕雌鼠体内移植衰老雌鼠胚胎51枚,年轻雌鼠胚胎16枚.在雌鼠孕期19.5dpc的时候,检测胎儿出生.我们发现移植了衰老雌鼠胚胎的假孕雌鼠有两个胎儿出生,而移植了年轻雌鼠胚胎的假孕有10只胎儿出生,衰老雌鼠胚胎严重降低了胎儿的出生率及妊娠率.
3.2高组蛋白乙酰化水平是衰老雌鼠胚胎生殖异常的一个主要原因
3.2.1衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平升高
影响衰老雌鼠胚胎发育能力低下的因素有很多.我们将研究的重点关注在基因组的表观修饰上来.表观遗传修饰包括DNA化和组蛋白乙酰化等.通过赖氨酸乙酰化的免疫荧光染色,我们发现衰老雌鼠的乙酰化染色的荧光强度极高（图3-2）.初步证明了衰老雌鼠的乙酰化程度增高.
3.2.2增加年轻雌鼠乙酰化程度获得与衰老雌鼠一样生理表型
我们尝试在体外培养环境下,增加年轻雌鼠胚胎的乙酰化程度进行体外模拟实验.TSA是一种去乙酰化酶抑制剂,通过向胚胎培养液中添加该试剂,可以显著提升胚胎的乙酰化程度.随后,我们通过向同为8周雌鼠的胚胎培养液中添加TSA来增加年轻雌鼠胚胎的乙酰化程度.
通过对到期雌鼠出生个数的比较,我们发现TSA处理后的年轻胚胎的雌鼠到期效率和年老雌鼠一致（图3-3）.实验结果说明,乙酰化程度升高后年轻雌鼠胚胎获得了和年老雌鼠胚胎一致的生理表型.
3.2.3TSA处理的年轻雌鼠胚胎具有和年老雌鼠类似的乙酰化程度
为了确定是否TSA处理后年轻雌鼠胚胎的乙酰化程度和年老雌鼠类似,我们通过免疫荧光的手段对胚胎进行染色.发现经过TSA处理后的雌鼠胚胎,具有了和年老雌鼠相类似的乙酰化程度.结果说明,乙酰化程度改变是衰老雌鼠胚胎质量变差的一个重要原因.
3.3乙酰化程度改变导致了一些关键性基因表达量改变
为了探究乙酰化程度改变为什么会造成动物流产等现象,我们利用qpcr技术对年轻、年老、TSA处理的胚胎受精卵进行了基因表达量的鉴定,通过鉴定,我们发现包括Peg10在内的多个对胚胎发育到期的重要基因的表达量相对于野生型较高,并存在显著差异（图3-4）.因此,乙酰化程度改变很有可能是增强了多个关键性基因的表达,从而导致基因表达紊乱,造成了胎儿发育雌鼠问题与障碍.
4结论
1.衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平增高；
2.通过体外模拟发现乙酰化水平升高是造成衰老雌鼠胚胎发育能力下降的一个主要原因；
3.乙酰化程度增高,改变基因表达水平使得基因表达紊乱.
5创新点
1.明确了乙酰化程度升高是雌鼠胚胎质量变差的一个主要原因；
2.证明了雌鼠流产问题很可能是乙酰化程度改变后造成基因表达量改变；
3.为人类胚胎质控提供一个新的质控标准.
责编/万海滨
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