CV的反向遗传系统,本文是遗传方面有关学士学位论文范文和反向遗传系统和C*V和反向类参考文献格式范文.
遗传论文参考文献：
[摘 要]对于家猪和野猪来说,猪瘟是一种具有极高传染力及高致死率的烈性传染病.猪瘟是由猪瘟病毒（ClassicSwine FeverVirus,CV）引起的病毒性传染病,CV 属于黄病毒科,瘟病毒属,是一种单股正义RNA 病毒.在CV 的研究当中,反向遗传学应用十分广泛,论文主要介绍几种比较成熟的CV 反向遗传系统.近年来,反向遗传学在CV 的研究方面得到不断发展,论文就CV 的几种反向遗传系统进行系统阐述,以期为CV 的研究及防控提供参考.
[关键词]CV；猪瘟；反向遗传学
【中图分类号】S852.65 【文献标志码】A 【文章编号】1673-1069（2018）12-0182-02
1 引言
反向遗传学是利用病毒的全长基因组来产生完整病毒的方法,是现在病毒学研究中最强有力的工具.反向遗传学通常用于研究病毒复制、感染、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1].近年来,反向遗传学在CV 的研究方面得到不断发展,本文就CV 的几种反向遗传系统进行系统阐述,以期为CV 的研究及防控提供参考.据统计,我国每年因猪瘟造成的经济损失已超过100 亿元.猪瘟严重阻碍养殖业的健康发展,并对食品安全造成威胁.因此,对该病进行全面、综合防控,具有必要的现实意义.本文对CV 及功能相关基因、蛋白的研究进展进行介绍,为全面了解CV、全方位防控猪瘟提供理论支持.
2 CV 的几种反向遗传系统
2.1 T7 RNA 聚合酶介导的体外转录反向遗传学系统T7 RNA 聚合酶,是一种高度特异识别T7 启动子序列的DNA 依赖的5´寅3´RNA 聚合酶.T7 RNA Polymerase 可以催化单链或双链DNA T7 启动子下游NTP 的掺入,合成与T7 启动子下游的模板DNA 互补的RNA[2].
Meyers(Meyers et al., 1996)首先对CV 5’到3’进行了全基因组鉴定,将CV 全基因组克隆到低拷贝质粒中,并在基因组3’端加入T7 启动子,利用Srf I 将质粒线性化后,在T7RNA 聚合酶作用下体外转录得到RNA,并转染进SK6 细胞系中拯救病毒,这一方法在现在的CV 研究中依然应用十分广泛.Fan(Fan et al., 2009)将上述方法进行了改进,将由T7 RNA聚合酶体外转录产生的vRNA 转染到BHK21 细胞系中,培养一段时间后,将含有病毒的上清感染PK15 细胞,用此方法得到的CV 病毒滴度是之前的8 倍左右.
2.2 T7 RNA 聚合酶介导的体内转录反向遗传学系统Gennip(Gennip et al., 1999)建立了一种更方便、高效的体内转录反向遗传系统.首先他建立了可以稳定表达T7 RNA聚合酶的SK6 细胞系SK6-T7 RNA pol,将线性化的CVcDNA 转染该细胞系,转录过程在细胞中完成并得到病毒RNA,产生CV 病毒,该方法大大提高了病毒滴度,其滴度约为体外转录的200 倍[3].Bergeron(Bergeron, 2002)通过在CV3’端插入了HDV 核酶及T7 终止子,构建了一种新型的基于T7 RNA 聚合酶的体内转录反向遗传学系统,该系统不需要Srf I 就能在CV 末端形成精确的3’NCR,节约了构建成本.
2.3 II 型RNA 聚合酶介导的反向遗传学系统
Li (Li et al., 2013) 在CV 5’NCR 加入CMV 启动子、T7启动子和HamRZ,在3’NCR 加入HdvRZ,T7 终止子和SV40polyA,HamRZ 与HdvRZ 可以生成正确的5’NCR 及3’NCR,且能在T7 RNA 聚合酶或者II 型RNA 聚合酶的作用下进行转录,该方法拯救的病毒滴度是体外转录的120 倍.
2.4 I 型RNA 聚合酶介导的反向遗传学系统
本实验室在上述基础上,构建了一种新的依赖pol 玉拯救病毒的CV cDNA 克隆,我们在PK15 细胞基因组中扩增得到猪的启动子,并参照文献合成在哺乳动物细胞中具有极高终止效率的鼠终止子,分别插入CV 5’NCR 之前和3’NCR 之后.该系统能直接将质粒转染到细胞中,拯救出CV 病毒,这种基于pol 玉启动子的反向遗传操作系统能产生具有精确末端基因组的CV,且具有更高的拯救效率,为后续修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发奠定了坚实的基础.
3 带有标记的CV 反向遗传系统
基于传统的反向遗传系统,具有标记或定量功能的CV cDNA 克隆被设计出来,如在Li 实验组建立了一种简化的中和抗体试验,用于检测CV,首先在Npro 后插入了EGFP 基因,在病毒产生的同时合成EGFP,从而省去荧光染色,达到检测病毒的目的[4].本实验室在1.4 中的反向遗传系统的基础上,在Npro 后面加入了Rluc 基因,得到了可以用于定量实验的CV 反向遗传系统,即可以通过收集Rluc 氧化过程中释放的生物荧光,定量地检测转录因子与目的基因的相互作用.
带有标记的CV 反向遗传系统在传统的反向遗传系统的基础上,进一步简化了实验步骤,在达到实验目的的同时,使反应更加快速,简便,增加了方法的实用性,为后续开展修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发做了很好的铺垫.
4 展望
反向遗传操作系统为RNA 病毒研究提供了一个强有力的平台,能够恢复具有全长病毒基因组的病毒[5].利用这个平台,人们可以通过基因重组、基因突变等手段来研究病毒的复制、感染,病毒蛋白的功能、病毒与宿主细胞之间的关系.抗病毒策略和标记疫苗的发展也离不开反向遗传操作,如找出与毒力相关性基因,对其进行缺失或修饰处理,从而得到新的无毒或减毒毒株,以此制备新型的减毒活疫苗,同时可以制备嵌合抗体,开发多价疫苗[6].反向遗传系统作为动物病毒的研究方法,已广泛应用于动物疫苗、CV 毒力机制及蛋白功能研究中,极大地推动了动物病毒的研究发展,为疾病的研究及防控起着重要作用.
【参考文献】
【1】Bergeron, L.J. Development and comparison of procedures for theselection of delta ribozyme cleage sites within the hepatitis B virus[J]. Nucleic Acids Research, 2002(30): 4682-4691.
【2】Fan, Y.F., Zhao, Q.Z., Zhao, Y., etc. Recovery of the InfectiousClassical Swine Fever Virus from the Cloned cDNA of LowTemperature Attenuated Thiverval Strain [J]. Chinese Journal ofAnimal & Veterinary Sciences,2009(40), 1420-1425.
【3】Gennip, H.G.P.v., Rijn, P.A.v., Widjojoatmodjo, M.N., etc.Recovery ofinfectious classical swine fever virus (CV) from full -lengthgenomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressingbacteriophage T7 RNA polymerase[J]. Journal of Virological Methods,1999(78): 117.
【4】Li, C., Huang, J., Li, Y., etc. Efficient and stable rescue of classicalswine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase IIsystem[J]. Archives of Virology ,2013(158): 901-907.
【5】Meyers, G., Thiel, H.J., R俟menapf, T . Classical swine fever virus:recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation ofrecombinant cytopathogenic defective interfering particles [J]. Journalof Virology,1996(70): 1588-1595.
【6】WU C W,CHIEN M S,HUANG C. Characterization of the swine U6promoter for short hairpin RNA expression and its application toinhibition of virus replication[J]. J Biotechnol,2013,168（1）：78-84.
汇总，此文是一篇关于反向遗传系统和C*V和反向方面的遗传论文题目、论文提纲、遗传论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文.
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