小麦小分子热激蛋白TasHSP16.9基因在逆境应答中的表达分析,该文是关于蛋白论文范文数据库与小麦和逆境和TasHSP16.9相关专升本论文范文.
蛋白论文参考文献：
李静婷,刘子记,赵旭耀,等. 小麦小分子热激蛋白TasHSP16.9基因在逆境应答中的表达分析［J］. 江苏农业科学,2016,44（7）：39-41.
doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.07.010
小麦小分子热激蛋白TasHSP16.9基因
在逆境应答中的表达分析
李静婷1, 刘子记2, 赵旭耀1, 朱小叶1
（1. 平顶山学院化学化工学院,河南平顶山 467000； 2. 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南儋州 571737）
摘 要：小分子热激蛋白(sHSP)是一类结构非常保守并具有分子伴侣功能的应激蛋白,可在高温和其他胁迫条件下诱导合成.为进一步研究sHSP在小麦耐胁迫性方面的作用,分析了小麦HSP16.9基因在逆境胁迫下的表达趋势,定量RT-PCR表达谱分析结果显示,高温、低温、干旱、高盐胁迫都诱导小麦TasHSP16.9表达,表达量均有增加,表明TasHSP16.9基因可能在小麦抗逆反应中发挥重要作用.
关键词：小麦；抗逆反应；基因表达；应激蛋白
中图分类号： Q786；S512.103.2文献标志码： A
文章编号：1002-1302(2016)07-0039-03
收稿日期：2015-11-02
基金项目：国家自然科学基金(编号：31501310)；平顶山学院高层次人才科研启动基金(编号：2011015G).
作者简介：李静婷(1983—),女,内蒙古包头人,博士,讲师,主要从事小麦遗传育种学研究.E-mail：jingting_lee@163.com.
热胁迫下,生物体内大部分蛋白质合成被抑制,分子量从8 ku至110 ku的热激蛋白(heat shock protein,HSP)被迅速诱导合成.在高等植物中,几乎所有的HSP都与细胞耐热性提高有关,其中表达最丰富的HSP为小分子热激蛋白(all HSP,sHSP).根据序列相似性和细胞内定位特征,植物sHSP分为6类,2类定位于细胞质,1类定位于细胞核内,其他3类位于质体、内质网、线粒体等细胞器内［1-3］.小麦小分子热激蛋白HSP16.9(TaHSP16.9)属于第一类小分子热激蛋白.研究发现,sHSP具有分子伴侣功能,以不依赖ATP的方式选择性地结合热变性蛋白防止其被蛋白酶降解或帮助其正确折叠［3］.此外,高等植物中的sHSP可在低温、光氧化条件、氧化剂、干旱等胁迫条件下,在特定的发育时期(如种子成熟、种子萌发)被大量诱导合成,在正常环境条件下sHSP表达量很低,几乎不表达,这表明sHSP可能在植物耐胁迫性方面发挥重要作用［2-9］.小麦是我国重要的粮食作物之一,其播种面积占全国耕地面积的20%～30%,随着全球气候的变化,小麦种植必然受到影响,尤其在我国北方小麦主产区.影响小麦生长发育和产量的生态因素较多,主要有温度、水分、光照、土壤性质等.由于温室气体排放量增加导致全球气候变暖,因此,近些年局部地区极端高温天气频发,导致小麦早熟、减产.同时,温室气体排放还导致我国水量分布不均,西南、华北、长江中下游地区降水量增加,西北和东部地区降水量减少,致使西南冬麦区和西北冬麦区减产［10］.近年来,由于气候干旱、过度放牧等因素,我国土壤盐渍化趋势逐渐加重,土壤肥力下降,导致小麦减产.培育抗性品种是提高小麦产量的有效手段之一,对小麦抗性相关基因功能的研究为培育小麦抗病品种提供了理论依据.笔者前期根据已公布的小麦16.9 ku sHSP基因的cDNA序列,利用Genome Walking技术克隆了TasHSP16.9基因全长,发现该基因只有1个外显子,没有内含子［11］.笔者利用PlantCARE数据库分析该基因启动子区域顺式作用调控元件,发现一些参与防卫反应和逆境应答的调控元件,推测TasHSP16.9基因可能参与小麦抗逆反应.本试验就TasHSP16.9基因对逆境应答模式进行研究,旨在为进一步研究TasHSP16.9基因在小麦抗逆反应中的作用奠定基础.
1材料与方法
1.1材料
供试小麦品种TAM107为耐热品种,由中国农业大学作物遗传育种系小麦组惠赠.试验所需引物由北京赛百盛生物技术公司合成,所用Trizol试剂、DNase I、TIANScript Ⅱ RT Kit、Taq PCR Mastermix均购自北京天根生化科技有限公司,SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa公司.
1.2方法
1.2.1非生物逆境胁迫条件的设定选取籽粒饱满的种子,采用1%次氯酸钠溶液表面消毒30 min,蒸馏水冲洗3遍,利用1%双氧水处理过夜,蒸馏水清洗3遍,选择露白的种子进行水培,在光照培养箱中培养,光—暗周期为16 h—8 h(昼—夜),昼夜温度22 ℃/18 ℃,湿度60%［11］.培养10 d后进行如下胁迫处理：(1)将小麦幼苗置于42 ℃ 进行高温胁迫处理,分别于处理后0.5、1.0、2.0、3.0 h取样；(2)将小麦幼苗置于0 ℃进行冷处理,处理后分别于3.0、12.0 h取样；(3)将小麦幼苗的根部冲洗干净并用吸水纸沾去多余水分,置于干燥滤纸上进行干旱处理,分别于处理后0.5、1.0、2.0、3.0、50 h取样［12］；(4)将小麦幼苗进行高盐(200 mmol/L NaCl溶液)胁迫处理,分别于处理后0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h取样；(5)将小麦幼苗进行200 μmol/L ABA溶液处理,分别于处理后 0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 h取样［13］.以未经处理的正常培养小麦幼苗作为对照,每个处理组重复3次.胁迫处理后迅速剪取叶片放入液氮中速冻,-80 ℃保存备用.
1.2.2总RNA提取纯化和cDNA第1链的合成利用 Trizol 试剂提取小麦叶片的总RNA,经DNase Ⅰ纯化后,电泳检测RNA的完整性,利用Thermo Scientific NaNoDrop 2000c检测RNA的浓度、纯度,利用TIANScript Ⅱ RT Kit试剂盒进行第一条单链cDNA的合成,-20 ℃保存备用.
1.2.3TasHSP16.9基因mRNA表达谱分析以小麦不同胁迫处理下不同时间点合成的第1链cDNA为模板,采用半定量RT-PCR法检测TasHSP16.9基因转录表达水平.以小麦Actin为内参,引物序列为Actin-L：5′-AATTACCCGATGGGCA-3′,Actin-R：5′-TCATACTCGGCCTTGGA-3′.扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,28个循环；72 ℃延伸10 min.TasHSP16.9特异性引物序列为TasHSP16.9-L：5′-AGTTCGTCAGGCGCTTCCG-3′,TasHSP16.9-R：5′-CGCAATACAGAGATGGCTCGTC-3′；扩增程序同上,33个循环.
以小麦冷胁迫处理后不同时间点合成的第1链cDNA为模板,用TasHSP16.9特异性引物(上游引物：5′-CGAGGTCAAGAAGCCTGAGG-3′,下游引物：5′-CGTCAGACTCGGCAAGAACA-3′)进行扩增,以小麦Actin为内参(上游引物：5′-ACTCATCATACTCGCCCTTCG-3′,下游引物：5′-CAAGCAGCATGAAGATCAAGGT-3′),利用实时定量PCR仪检测TasHSP16.9在冷胁迫下的表达模式,每个样品至少独立重复3 次.反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 10 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸20 s,38个循环.每次循环的第3步设定荧光采集,绘制融解曲线.采用荧光定量PCR仪自动读取的数据进行分析［14］.
2结果与分析
2.1TasHSP16.9启动子的生物学分析
为了进一步探究TasHSP16.9的转录调控模式,本研究前期克隆到TasHSP16.9启动子序列(ATG起始子上游 1 115 bp 的基因组序列),利用PlantCARE数据库(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析该基因启动子区域的顺式作用调控元件(表1),发现TasHSP16.9启动子含有一系列对低温、厌氧、防卫、逆境应答的调控元件(LTR、ARE、TC-rich repeats),还含有茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)、机械损伤诱导响应元件(W-box)、光响应元件(Box I、G-Box、GT1-motif等)、真菌诱导响应元件(Box-W1)、参与分生组织和胚乳发育调控元件(CAT-box、Skn-1-motif)、典型的启动子核心元件(TATA-box)和增强子元件(CAAT-box).
2.2非生物胁迫下TasHSP16.9基因表达模式分析
为了明确小麦小分子热激蛋白基因TasHSP16.9在抗逆反应过程中的具体作用,采用半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR方法分析TasHSP16.9在高温、低温、干旱、高盐、ABA处理后小麦幼苗中的表达情况.结果表明,TasHSP16.9对高温诱导反应较灵敏,处理后0.5 h即可检测到较强的表达量,此后随诱导时间的延长表达量逐渐升高,3.0 h达到最高(图1-A).干旱胁迫下,处理后0.5 h能检测到该基因的微量表达,2.0 h表达量最高,此后随胁迫时间的延长表达量逐渐下降,5.0 h处已检测不到(图1-B)；TasHSP16.9对高盐胁迫诱导反应较迟缓,1.0 h后才检测到基因表达,3.0 h处表达量达到高峰,此后表达量明显下降(图1-C)；在ABA处理下,检测不到TasHSP16.9基因表达,即TasHSP16.9表达不受外源ABA影响(图1-D).TasHSP16.9基因对低温胁迫应答反应缓慢,3 h处检测到该基因表达,处理3 h后表达量降低,恢复到常温水平(图2),说明非生物逆境胁迫能快速诱导TasHSP16.9基因表达,但只诱导该基因mRNA在短期内的积累,诱导一定时间后,该基因的诱导表达将会受到抑制,该基因mRNA会迅速降解.TasHSP16.9基因表达谱分析结果表明,高温、干旱、高盐胁迫诱导TasHSP16.9表达,低温胁迫对其诱导表达不显著,外源ABA对该基因表达没有影响.
3结论与讨论
小麦是我国乃至全球重要的粮食作物之一,在气候恶化、环境污染、病虫害侵染等因素的影响下,小麦的种植、生长、产量受到严重威胁,提高小麦的抗病虫害和抗逆性已成为当前小麦遗传育种工作的主要目标.当高等植物受到高温或持续升温胁迫时,细胞内会迅速诱导合成大量热激蛋白,其中以sHSP最为丰富.研究表明,诸多非生物胁迫(如高温、低温、干旱、氧化剂等)都可诱导sHSP的产生.如过表达sHSP17.7可以显著提高转基因水稻的耐旱性［4］.热激和冷处理可诱导紫茎泽兰HSP17.7基因的表达［5］.高温和低温可诱导番茄线粒体小分子热激蛋白LEHSP23.8基因的表达［6］.高温和氧化剂H2O2可诱导水稻叶绿体小分子热激蛋白OsHSP26基因的表达［8］.高温可快速诱导玉米ZmHSP17.7基因的表达［15］.
TasHSP16.9启动子区具有LTR、ARE、TC-rich repeats 3种参与低温、厌氧、防卫和逆境应答的顺式作用元件,这些顺式作用元件可以增强植物对非生物胁迫的抗性,推测TasHSP16.9基因可能参与小麦抗逆反应.本研究表达谱分析结果显示,高温、低温、干旱、高盐胁迫均可诱导TasHSP16.9表达,其中低温胁迫对该基因诱导表达不显著.42 ℃ 高温胁迫下,0.5 h处即可在小麦苗期叶片中检测到TasHSP16.9基因显著表达,3.0 h处基因表达量达到高峰,这种高温诱导的特性与其他植物中小分子热激蛋白基因的表达特性一致,而且胁迫温度越高,基因表达响应越快,基因表达量达到高峰所需时间越短,如40 ℃高温胁迫下,处理1.0 h后才可在小麦苗期叶片中检测到TasHSP16.9-1基因的表达,在胁迫4.0 h后基因表达量才达到高峰［16］.但TasHSP16.9基因诱导产物不随胁迫时间的延长无限积累,当表达量达到高峰后很快下降,直至完全消失.本研究中,在低温、干旱、高盐胁迫下,TasHSP16.9基因诱导表达量达到高峰后,随着胁迫时间的延长,表达量显降低直至完全消失.40 ℃高温胁迫下,TasHSP16.9-1 基因在胁迫4.0 h时表达量达到高峰,随后逐渐降低［16］.推测本研究中TasHSP16.9基因表达量在热胁迫3.0 h后,随着热胁迫时间的延长,表达量将逐渐降低.ABA在植物响应非生物胁迫过程中具有重要功能,根据基因是否受ABA调控,往往将基因分为2类,即依赖于和不依赖于ABA的胁迫响应基因.TasHSP16.9表达不受外源ABA诱导,表明该基因属于不依赖于ABA的胁迫响应基因.但需要进一步就内源ABA是否影响该基因表达进行验证.通过分析非生物胁迫下TasHSP16.9基因的表达谱,结果表明,小麦TasHSP16.9参与对逆境胁迫抗逆反应过程,今后本研究将利用转基因拟南芥对TasHSP16.9V的生物学功能作进一步验证,以明确该基因在小麦抗逆反应过程中的调控功能,为小麦抗性育种提供理论参考.
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概括总结,上文是一篇关于对不知道怎么写小麦和逆境和TasHSP16.9论文范文课题研究的大学硕士、蛋白本科毕业论文蛋白论文开题报告范文和文献综述及职称论文的作为参考文献资料.
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