甲醇酵母细胞胞内蛋白纯化,本文是细胞方面有关毕业论文格式模板范文和甲醇和酵母和蛋白纯化研究类电大毕业论文范文.
细胞论文参考文献：
柳苏玲
（湖南大学 湖南长沙 410006）
摘 要：甲醇酵母细胞胞内蛋白敦化可以选择使用碱溶方法、离心方法、破壁方法、酸沉方法.主要研究的内容是甲醇酵母细胞胞内蛋白纯化额条件.在研究之后得到以下结果：相比较生物酶解处理方法、热碱处理方法以及高压均质处理方法,热碱与高压均质联合处理法可以从根本上提升细胞破壁效率.在100 MPa压力、PH值等于10．0的条件下进行两个小时的60℃热处理,并且完成三次均质操作,那么其得到的细胞破壁率可以达到87．60%.如果PH等于4．5,在破壁之后,可以得到最大的上清液蛋白沉淀量,处理之后得到的粗蛋白质含量可以达到82．5%（在纯化甲醇蛋白中）,可以取得非常显著的、理想的甲醇酵母细胞胞内蛋白纯化效果.
关键字：甲醇酵母；细胞；胞内蛋白纯化
通过发酵的形成,将以甲醇、磷酸等作为培养基的甲醇蛋白进行处理,单细胞菌体是甲醇酵母细胞的主要部分,在完成再一次提炼的基础上得到单细胞蛋白部分.在完成甲醇酵母细胞提取的基础上,得到的是完全无毒的单细胞蛋白产品,相对于其他植物性原料来说,存在的氨基酸含量非常的丰富,所以这是一种具备非常丰富营养价值的蛋白质产品[1].本次研究主要利用的是碱溶方法、离心方法、破壁方法、酸沉方法完成甲醇蛋白粗品经过的制取,最后实现甲醇蛋白的钝化,主要研究的是甲醇酵母细胞的胞内蛋白质纯化的正确途径,为后期有效的利用甲醇蛋白提供有效的基础前提[2].
1选择材料与方法
1.1实验材料的选择
首先是原料的备制跟试剂的备制[3].于广西南宁庞博生物工程有限公司购取酵母破壁酶试剂；甲醇蛋白粗品是自制的,甲醇蛋白粗品成分,详细成分如下：粗蛋白质占比例为50.00%；粗脂肪占比例为11.50%；粗纤维占比例为7.40%；水分占比例为18.50%；粗灰分占比例为12.60%.剩下其他的试剂都是分析纯类别.
其次是仪器的备制与设备的备制.在意大利的GEA Nrio公司购进BD-1A-70冷冻干燥机以及NS 1001L高压均质机,同时购进Q/SGYM1008电子天平.继而于梅特勒托利多公司购进Delta 320酸度计.最后购进SHA－B水浴恒温振荡器、TDL－5A离心机以及K－S24恒温水浴锅[4].
1.2实验操作方法
1.2.1测定细胞破壁率大小
在处理之前跟处理之后,分别取1ml的甲醇蛋白细胞悬液,对甲醇蛋白细胞悬液进行显微镜观察操作,操作之后使用血细胞计数完整形态的细胞数量,计数要求是,每一样品完成五次计数,之后计算得到其平均值大小.在破壁之前跟之后,细胞破壁率指的就是,在破壁前细胞数中,具有完整形态细胞数之差的比例大小使用“%”表示.
1.2.2测定蛋白释放量大小
在完成破壁处理之后,甲醇蛋白粗品干重跟上清液中蛋白质总量的比例就是蛋白释放量大小.
1.2.3甲醇蛋白酸的沉纯化
在选择满足甲醇蛋白细胞破壁处理方法的基础上,取五份25%甲醇蛋白粗品溶液,每一份为500 m L,在完成处理之后,对其进行离心操作,完成上清液的收集,之后使用盐酸,将上清液PH值调节,促使其达到：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0,之后完成二十分钟的静置操作,并且进行离心操作,每分钟5 000 r,离心时间为10分钟,就可以得到蛋白沉淀.之后冷冻干燥蛋白沉淀,对其进行称重,之后按照计算的原则完成蛋白沉淀中粗蛋白质含量大小的计算.
2结果
2.1对甲醇蛋白细胞破壁均质次数的影响
均质处理甲醇蛋白粗品溶液,基于100 MPa条件以及PH等于 9．0条件下,假设为1次～5次的均质次数,详细如下图1所示.
图1对甲醇蛋白细胞破壁均质次数的影响
分析上图得到,完成三次均质之后,超过80%的细胞都可以实现有效的破壁,并且还会不断的增加胞内蛋白释放量.在实际工作中,如果存在超过三次的均质次数,没有办法从根本上提升细胞破壁率以及没有显著提升蛋白释放量.
2.2甲醇蛋白酸的沉纯化
在不同PH下以及100 MPa跟PH等于10．0条件,3次均质25%甲醇蛋白粗品溶液（500 m L）,之后进行离心,取得上清液蛋白沉淀量,详细如下所示：
图2甲醇蛋白酸的沉纯化
分析上图得到,在PH等于4．5的时候,可以取得最大的蛋白沉淀量,可以达到51.00g最多.同时随着PH值的不断增加,之后呈现一个不断的蛋白沉淀量降低趋势.分析上述结果可以得到以下结论：蛋白质的等电点（从甲醇酵母细胞中提纯的）大致上PH等于4．5.在进行蛋白沉淀的过程中,只要是高于PH值的或者是低于PH下,都会存在蛋白质损失的情况.PH如果等于4．5,在这个条件下得到的粗蛋白质含量（纯化甲醇蛋白产品中）可以达到82．50%,可以取得非常理想的纯化效果.
3讨论
综上所述,在完成相关的分析之后,相比生物酶解处理法来说,热碱与高压均质联合处理方法可以从根本上提升细胞破壁效率,同时高压均质处理法以及热碱处理法的细胞破壁效率提升率相比热碱与高压均质联合处理方法来说较低.本次研究取得了热碱均质处理的最满意条件,那就是PH等于10.0,在60℃的环境下,完成两个小时的热处理,在100 MPa压力条件下,完成3次的均质处理,所以其细胞的破壁率会达到87.60%.如果PH值等于4．5,在破壁之后,会存在最大的上清液蛋白沉淀量,粗蛋白质含量的所得纯化甲醇蛋白中达到82.5%,可以取得非常显著的、理想的纯化效果.
参考文献：
[1]李素霞,袁勤生.重组羧肽酶原B甲醇酵母的构建与分泌表达[J].食品与药品,2008（11）：5-7.
[2]王志方,艾秀莲,李晨华,王玮,张伟,冯怀蓉,王成.甲醇酵母基因表达系统研究[J].新疆农业科学,2002（04）：222-224.
[3]黄秀东,杨红,张高峡,李树刚,于廷和.酶法测定甲醇酵母发酵液中甲醇浓度[J].生物技术,2001（02）：23-25.
[4]彭毅,杨希才,康良仪.影响甲醇酵母中外源蛋白表达的因素[J].生物技术通报,2000（04）：33-36.
作者简介；柳苏玲（1991.11-）女,江西萍乡人,硕士,研究方向：细胞组织与工程
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