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曹芳芳,李娟,刘海峰. 山葡萄DFR基因全长cDNA的克隆与序列分析［J］. 江苏农业科学,2016,44（7）：34-38.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.07.009

山葡萄DFR基因全长cDNA的克隆与序列分析

曹芳芳, 李娟, 刘海峰

（延边大学农学院,吉林延吉 133000）

摘 要：应用RT-PCR和 ART RACE等技术克隆山葡萄二氢黄酮醇4-还原酶基因的全长cDNA序列,结果表明,该基因全长1 362 bp,包括1 014 bp的完整开放阅读框,推测其编码337个氨基酸.该基因表达产物相对分子质量为37.50 ku,等电点为5.95,是稳定蛋白,不包含信号肽.蛋白质疏水性分析结果表明,DFR疏水性最大值为2.511,最小值为-2.267,平均值为-0.146,整体表现为亲水性.二级结构分析结果表明,DFR的二级结构主要以α-螺旋(35.31%)和不规则卷曲(46.29%)为蛋白最大量的结构元件.对不同植物DFR氨基酸序列进行多重比对发现,同源性较高,DFR与NADPH结合区域和底物结合区域都表现出高度保守.用推导的氨基酸序列与蛋白质数据库进行同源性比较,其氨基酸序列与欧亚种葡萄、大豆、矮牵牛等植物的DFR氨基酸序列两两比对的相似性系数分别为98%、76%、74%.

关键词：山葡萄；二氢黄酮醇4-还原酶；克隆；序列分析

中图分类号： S663.101文献标志码： A

文章编号：1002-1302(2016)07-0034-05

收稿日期：2015-06-05

基金项目：国家自然科学基金(编号：31260067).

作者简介：曹芳芳(1989—),女,吉林松原人,硕士研究生,主要从事山葡萄基因克隆研究.E-mail：caofangfang1207@163.com.

通信作者：刘海峰,博士,副教授,从事山葡萄分子生物学研究.E-mail：shiyanshiqixiang@163.com.

山葡萄(Vitis amurensis)为葡萄科葡萄属多年生藤本植物,植株似葡萄而细小.山葡萄是葡萄属中最抗寒的一个种,是葡萄属植物抗性育种的珍贵资源,已被多个国家和地区所重视.山葡萄是一种经济价值很高的野生经济植物,成熟后的果实味甜酸,富含果汁,可生食,用山葡萄浆果酿造的葡萄酒品质优良,是我国东北地区葡萄酒工业的主要原料.葡萄酒具有预防心脑血管疾病的作用,原花青素［1］是其中最主要的作用成分.研究表明,原花青素存在较强的抗氧化活性和抗癌活性,对降低毛细血管的渗透性有重要的药理作用.葡萄酒的品质与葡萄中原花青素的含量有直接关系［2］.花青素类化合物也是植物中可溶性天然色素的主要来源,因此研究花色苷植物资源有重要意义.花青素直接或间接影响果实的外观颜色形成,在合成花青素过程中［3］,DFR(dihydrofla-vonol 4-reductase,二氢黄酮醇-4-还原酶) 起决定性作用.DFR反应需要NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)的参与.DFR依赖DHM(dihydromyricetin,二氢杨梅黄酮)、DHK(dihydrokaempferol,二氢堪非醇)、DHQ(dihydroquercetin,二氢栎皮黄酮)3种底物,它们结构相似,只在B苯环上的羟基数目上不同,DFR将DHM、DHK、DHQ底物还原,分别生成相应的无色花翠素、无色花葵素、无色花青素［4］,通过后续途径最终将无色的二氢黄酮醇转化合成有色花色素［5］.不同物种DFR对3种底物具有选择特异性［6］,所以能合成不同的花色素［7］,导致植物呈现出不同的花色、果色.DFR基因最早由OReilly等于1985年从金鱼草(Antirrhinum majus)和玉米(Zea mays)中分离得到［8］.目前,研究人员已经从许多不同的植物中成功分离出DFR及其他基因［9］,但对山葡萄中的DFR研究尚未见报道.本研究以山葡萄为试验材料,利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)等方法［10］克隆DFR全长基因,成功得到山葡萄DFR基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析以及序列比对,旨在为分析及调控山葡萄中花色苷的合成提供依据.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料试材山葡萄双丰(V.amurensis ‘Shuang Feng’)采自国家山葡萄种质资源圃,采摘无病虫害、饱满的成熟期果粒,立即置于液氮中冷冻,-80 ℃冰箱中保存,取其果皮作为供试材料.

1.1.2试剂材料Tris-HCl、CTAB、EDTA、LiCl、β-巯基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal为AITiresco分装试剂；大肠杆菌(Escherichia coli) DH5-α、pMD19-T载体、Taq酶、Marker DL2000购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购于Omega公司；反转录酶SuperScript Ⅱ购自Invitrogen公司；ARTTM RACE试剂盒购于Clonteeh公司；其他试剂为国产分析纯.引物由英俊生物技术有限公司合成,DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

1.2方法

1.2.1引物设计登录NCBI网站,根据GenBank中已登陆的DFR基因的核苷酸序列和氨基酸序列,通过多序列比对确定其共有的保守区,利用Primer 6.0设计1对特异引物(用来扩增目的片段)：VAmDFRs,5′-TCATCGGTTCATGGCTGGTC-3′；VAmDFRa,5′-CAGTTATGAGGCTTGGAGGC-3′.

1.2.2山葡萄果皮总RNA的提取及cDNA的合成采用改良的CTAB法［11］提取山葡萄果皮中的总RNA.用紫外分光光度计测定其D230 nm、D260 nm、D280 nm及总RNA浓度,用1% TAE检测RNA的完整性.按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反转录酶试剂盒说明书,以Oligo(dT)20为引物,总RNA为模版,进行逆转录反应合成cDNA第1条链.

1.2.CR扩增目的基因片段PCR扩增反应体系如表1所示.

扩增反应程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 退火1 min,72 ℃退火2 min,72 ℃ 延伸7 min,35个循环.用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,回收纯化目的片段.

1.2.45′-RACE和3′-RACE片段的获得用ARTTMRACE cDNA Amplification Kit方法进行RACE cDNA扩增.根据保守区测序结果,克隆中间片段的引物可以继续用于RACE,其中VAmDFRs用作3′-RACE引物,VAmDFRa用作5′-RACE引物.继续扩增所得到的程序,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物确定条带.

1.2.5目的片段的回收和连接按照胶回收试剂盒说明书对PCR产物的DN段进行回收、连接与转化.将回收的DN段与pMD-19载体连接,16 ℃连接3 h.反应体系为pMD-19载体 0.5 μL DN段4.5 μL、SolutionⅠ5 μL.

1.2.6转化将DH5-α感受态细胞解冻后,取50 μL加入10 μL连接产物,冰浴30 min；取出后热激90 s,置于冰上2~3 min；加入预热的LB液体培养基300 μL,37 ℃ 190 r/min培养1 h；取适量菌液,涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固体培养基平板上,37 ℃培养箱中倒置培养过夜.次日,挑白色单克隆置于37 ℃培养箱中,200 r/min培养12 h.随后进行菌液PCR检测,将成功克隆的菌样测序.

1.3VamDFR基因序列及推测蛋白质的生物信息学分析

用DNAstar软件查找VamDFR基因的开放阅读框(ORF)并推导其氨基酸序列；利用 NCBI的BLAST程序检索数据库,对VamDFR基因全长cDNA序列及其氨基酸序列进行比对分析.利用在线软件(表2)进行生物信息学分析,采用GeneDoc软件进行多序列比对,并用MEGA 6.0软件构建系统进化树.

2结果与分析

2.1山葡萄VamDFR基因cDNA全长的克隆及序列分析

采用改良的CTAB法提取成熟期葡萄果皮中的总RNA,总RNA质量合格,无降解.将其反转录合成cDNA模板,用DFR基因引物VAmDFRs、VAmDFRa进行PCR扩增,获得目的特异条带,约580 bp,与预期片段大小相近.产物经连接转化,筛选测序后获得保守序列片段,用NCBI/BLAST程序进行同源搜索,结果与Vitis vinifera基因的相似性为98%.参照RACE试剂盒说明,以逆转录分别合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA为模板,GSP与UPM为引物,分别进行5′-RACE和3′-RACE扩增,结果如图1所示.以3′-RACE-Ready-cDNA为模板,DFRs与UPM为引物扩增得到1 241 bp条带.以5′-RACE-Ready-cDNA为模板,DFRa与UPM为引物扩增得到约702 bp 条带.阳性对照反应用GSP1、GSP2为引物进行扩增,得到与预期大小相同(约580 bp)的条带.阴性对照单引物扩增,没有条带产生.

将5′-RACE和3′-RACE测序结果应用Vector NTI Ssuire 9.0软件去除载体序列后拼接获得cDNA全长.应用DNAStar软件对获得的山葡萄DFR进行开放阅读框分析,并将其推导为相应的氨基酸序列,结果显示,该基因全长 1 362 bp,包括1 014 bp完整开放阅读框、76 bp 5′-非转译区、272 bp 3′-非转译区,推测其编码337个氨基酸,GenBank登录号为FJ645768,将其命名为VamDFR.

2.2VamDFR基因编码蛋白质理化性状分析

利用ProParam工具在线预测分析VamDFR基因编码蛋白的理化性质,发现该蛋白由337个氨基酸组成,分子量(MV)为37.50 ku,等电点值为5.95. 正电荷残基(精氨酸+赖氨酸)37个,负电荷残基(天冬氨酸+谷氨酸)42个,不稳定指数34.68,脂肪指数81.31,表明VamDFR基因蛋白属于稳定蛋白质.

2.3VamDFR蛋白保守区预测

利用NCBI的BlastP,在蛋白保守区数据库对山葡萄VamDFR基因进行蛋白保守区预测,VamDFR有多个保守域,如cd05193(AR_like_SDR_e)、PLN02583(PLN02583)、pfam01073(3Beta_HSD)等,该基因应属于DFR超基因家族［12］(图2).

2.4VamDFR蛋白的亲水性分析

利用ProtScale程序分析了山葡萄VamDFR蛋白氨基酸序列的亲水性/疏水性(图3).图中纵坐标为氨基酸标度值,横坐标为氨基酸序列位置.依据氨基酸分值越低亲水性越强,分值越高疏水性越强的规律,结果显示,VAmDFR疏水性最大值为2.511,最小值为-2.267,疏水性平均值为

-0.146；可明显看出疏水性最大值在第168位点,值为 1.900；最小值在第145位点,值为-2.722；总平均亲水性指数为-0.146,整体表现为亲水性.

2.5VamDFR蛋白的跨膜结构域分析

根据TMHMM和TMpred Server网站分析,超过500分的才被认为显著.从分析结果中可以得出,VamDFR蛋白无跨膜螺旋,所以可推测VamDFR不含有跨膜结构域.

2.6VamDFR蛋白的信号肽预测及二级结构分析

利用SignalP4.1 Server对山葡萄VamDFR基因蛋白进行信号肽预测,结果表明,VamDFR基因编码的蛋白不具有信号

肽.利用网上资源HNN在线预测VamDFR二级结构 (图4),结果显示,该蛋白的二级结构由35.31%的α-螺旋、46.29%的不规则卷曲和18.40%的延伸链组成.

2.7山葡萄VamDFR编码蛋白质的同源性及进化分析

用推导的氨基酸序列与蛋白质数据库进行同源性比较,其氨基酸序列与欧亚种葡萄(V. vinifera,X75964)、圆叶葡萄(V. rotundifolia,K60268)、苹果(Malus domestica,XM_008379159)、大豆(Glycine max,NM_001251683)、飞燕草(Delphinium grandiflorum,LC029441)和矮牵牛(Petunia hybrida,X15537)等植物的DFR氨基酸序列两两比对的相似性系数分别为98%、98%、81%、76%、77%、74%,多序列比对结

果见图5.

山葡萄(V. amurensis,FJ645768)、欧亚种葡萄(V. vinifera,X75964)、圆叶葡萄(V. rotundifolia,K60268)苹果(M. domestica,XM_008379159)大豆(G. max,NM_001251683)、飞燕草(D. grandiflorum,LC029441)和矮牵牛(P. hybrida,X15537)VAmDFR中含有与NADPH结合的保守基序(V8-Y30)［13］和26个氨基酸组成的底物特异结合的保守基序(T131-K156),其中N132和E144直接影响DFR的底物特异性,不同物种存在一定差异,Q138、Y142、D149、F152非常保守［7］.这些位点在结构和功能上均与已知的葡萄VvDFR(CAA72420)及其他DFR蛋白相似,而且都在相同或相近的位置,从而可推断VAmDFR属于NADPH依赖的还原酶家族中的二氢黄酮醇4-还原酶.

用MEGA 4软件对该基因及其他植物的DFR氨基酸序列进行多序列比对,绘制分子进化树,结果(图6)表明,山葡萄VAmDFR氨基酸序列与欧亚种葡萄(V.vinifera,X75964)、圆叶葡萄(V.rotundifolia,K60268)、美国蔓藤(A.grossedentata,KC753780)、棉花(G.hirsutum,EF187441)、脐橙(C.sinensis,NM_001288931)可归为一类,亲缘关系较近；与水稻(O.sativa,AF134807)、玉米(Z.mays,NM_001158995)、小麦(T.aestivum,AY209183)、荠菜(B.juncea,GU230159)、拟南芥(A.thaliana,M86359)、飞燕草(D.grandiflorum,LC029441)等亲缘关系较远.

3结论与讨论

植物的花色和果色主要受花色素直接或间接控制,DFR是合成花色素苷的关键酶,因此研究DFR意义重大,DFR是单基因编码的NADPH依赖性短链还原酶家族［14］.对不同物种的DFR基因编码的氨基酸序列进行同源性比较,发现有2个保守区域,其中底物特异性选择结构域是由26个氨基酸组成［15］.DFR分子中底物结合区的氨基酸序列决定它对不同

底物的结合,此序列在不同物种中也是高度保守的［16］.研究表明,保守区域中存在的132、141位氨基酸对酶的底物特异性有很大影响,大部分的物种在132位是D(天冬氨酸)或N(天冬酞胺).当132位氨基酸为D时是ASP型DFR,为N时是ASN型DFR,也存在少数既不是D也不是N的,被称作非ASP/ASN型DFR［7］.Johnson等在矮牵牛中发现,它的132位氨基酸为天冬氨酸,它的DFR主要催化DHM,其次是DHQ,而对DHK则无作用［7］,不能利用DHK为底物生成天竺葵素,但许多132位是天冬酞胺的植物能利用DHK作为底物［17］.本试验克隆得到的山葡萄DFR基因编码的氨基酸在132位是N,为ASN型,推测它能够催化DHK生成无色花葵素,也有报道在山葡萄果皮中检测到花葵素［18］,更加确定了笔者这一观点.有关山葡萄花色素组成成分的报道中也有花青素、花翠素的存在,由此推测DFR基因可能不是单拷贝,而是多基因拷贝.

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上文结束语,上文是适合山葡萄和克隆和序列分析论文写作的大学硕士及关于克隆本科毕业论文，相关克隆开题报告范文和学术职称论文参考文献.

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