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qPCR 即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统.昆山吉和力仪器有限公司整理了一些关于qPCR 的常见问题,并对这些问题一一进行了解答.
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qPCR 的英文全称是Real-timeQuantitative PCR Detecting System,即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称qPCR.
简单来说,qPCR 就是利用荧光信号的变化,实时监测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析.而常规的PCR 无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时监测.
如何提高RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？
①确定模板RNA 完整性,无DNA污染；
② RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂；
③为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase 抑制剂RNasin；
④使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱；
⑤若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；
⑥设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构.
避免RNA 降解的方法有哪些？
①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA；
②运用良好无污染技术分离RNA；
③将组织从动物体取出后立刻提取RNA,并将提取好的RNA 反转录为cDNA 进行低温保存.
RNA中含有逆转录抑制剂时,怎么处理？
逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐,可将对照RNA 与样品混合,同对照RNA反应比较产量以检测RNA 抑制剂；若对照RNA 与样品混合后产量降低,则说明样品中存在逆转录抑制剂,可用70%（v/v）乙醇对RNA 沉淀进行清洗,以除去抑制剂.
如何减少RNA 模板中的二级结构？
①将RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性、退火,提高逆转录反应温度；
② 温度超过60 ℃ 时, 不能使用oligo（dT）引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP；
③ RT-PCR 产物的长度超过1kb时,反应温度需保持在65℃.
RNA 中有DNA 污染的处理方式①若是基因组DNA 的污染,可使用DNaseI 处理RNA,同时设置没有逆转录对照组反应检测DNA 污染；
②若是受到外源DNA 的污染,可使用抗气雾剂和UDG 酶.
qPCR 探针设计的一般原则有哪些？
①扩增片段的长度不应太大,一般小于300bp；
②探针不能和任一引物互补,且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短,长度不要超过30bp；
②探针的Tm 值至少比引物的Tm值高5 度；
③探针如用于检测多态位点,多态位点应尽可能靠近探针中部；
④探针5’端不能是碱基G,G 对荧光基团有猝灭作用.
无反转录酶情况下,对照RNA 仍有扩增结果
①体外转录时不可能将所有DNA模板消除,因而对照组会含有痕量的DNA.建议可将第一链cDNA 稀释1:10、1:100、1:1000 倍以消除DNA 污染造成的影响；
②可能是引物二聚体的条带.
扩增产物滞留在加样孔中
①可能是由于模板量过高而导致PCR 结果产生了高分子量的DNA 胶状物,建议将第一链cDNA 浓度稀释至100 倍再进行二次扩增；
②在二次PCR 时,使用的退火温度如果比引物的Tm 值低5℃,可将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性.
无Ct 信号出现
①反应循环参数不够,一般要在35 个循环以上,但是过多的循环次数可增加背景值；
② 检测荧光信号的步骤有误.SYBRgreen 法（SG 法）采用的是72℃延伸时采集荧光信号,taqman 法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集；
③引物或探针降解,可用PAGE 电泳检测其完整性,若是电泳条带呈弥散状,可考虑重新合成引物或探针；
④模板不足或降解,则可以重新提取核酸模板.
Ct 值出现过晚（Ct>38）①扩增效率低,反应条件不够优化,降低退火温度,增加镁离子浓度；
②反应成分降解或加样量不足；
③ PCR 产物过长,一般采用80-150bp.
标准曲线线性关系不佳
①加样存在误差,是样品浓度不成梯度；
②标准品出现降解, 避免反复冻融；
③引物或者探针设计不佳；
④模板中存在抑制物或模板浓度过高.
溶解曲线存在多个主峰
①引物设计不够优化；
②引物浓度不佳,上下游引物浓度比例不一致；
③镁离子浓度过高；
④模板基因组的污染.
同一样品中,其中某一个荧光信号特别强
①试剂配制时反应液没有完全溶化,导致探针量在一管增多；
②试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同；
③ PCR 仪热槽被荧光物质污染,需要清除热槽中的污染.
扩增曲线有一向上或向下的尖峰？
①反应过程中电压不稳定；
②可能在20 个循环左右时,仪器有停下或仪器有开盖,使光线突然增强；
③如果尖峰向下,可能是由卤素灯老化所致,这时应更换.
部分样本扩增效率过低？
①提取液残留,一定程度抑制了PCR 反应；
②反应液未严格取量混匀或分装不均匀；
③试剂失效.
阴性对照或空白对照翘尾
①模板提取环境或操作过程有污染；
②配液过程存在污染.
直线型扩增曲线
①探针部分降解：一般稀释的探针可在4℃保存至少3 个月,探针的反复冻融或导致降解；或者探针在光线下暴露时间太长了；
②反应液中有PCR 抑制物.
没有扩增曲线
① PCR 参数设置错误,在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步,即stage1 阶段；
②电脑设定了自动休眠.
基线下滑
基线选取范围不对,可试着将基线范围改大一些,这一问题常因试剂质量所致.
扩增曲线断裂
基线选取范围不对,基线终点大于Ct 值,这通常是由于模板DNA 浓度过高所致,因Ct 值<15,而基线范围仍取3~15,其中包含部分扩增信号,导致标准差偏大,阈值过高,解决办法：减少基线终点至Ct 前4 个循环,重新分析数据.
样品浓度跨度过大
样品浓度过高,导致阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线,其解决方法同“扩增曲线断裂”.
山坡形曲线
常因反应管封口不严,至反应液蒸发所致.
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