内生菌对葡萄生长发育与酿造的影响进展,该文是有关生长发育研究生毕业论文范文和葡萄和葡萄生长发育和内生菌类电大毕业论文范文.
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摘 要：内生菌对葡萄生长发育和葡萄酒酿造具有重要影响.针对内生菌的特性与功能,综述了葡萄生长期间内生菌的变化对果实品质的影响,以及葡萄酒酿造过程中内生菌对酒的颜色、酚类物质稳定性的重要作用.进一步阐述了葡萄酒内生菌群落多样性与主要色素类物质之间的相关性,内生菌类群动态对各色素类物质和与色素类物质相关物质变化的响应机制.并提出了目前内生菌的常用鉴定及分离方法,为探讨内生菌与葡萄品质和葡萄酒颜色之间的关系,及内生菌对葡萄酒陈酿期间的颜色变化机制奠定基础.
关键词：内生菌；葡萄品质；葡萄酒色泽；稳定机制；类群动态
中图分类号：S663.1 文献标志码：A
DOI：10.13414/j.cnki.zwpp.2018.02.011
葡萄酒颜色的稳定性是葡萄酒的重要特征之一,葡萄酒从贮存、运输到货架期间颜色、口感和香气的平衡,及葡萄酒的营养、健康与安全都受到葡萄酒颜色稳定性的影响.因此,生产颜色纯正且稳定的葡萄酒是保证葡萄酒质量的关键瓶颈.
葡萄酒发酵过程是由各类微生物和酶参与的复杂的生化反应过程[1].在葡萄酒发酵过程中,葡萄梗、籽、皮和果肉中的糖、酸、色素、单宁、蛋白质、胶体和香气物质等通过浸渍、发酵和生化反应等相互渗透、结合、分解、转化[2],导致葡萄酒颜色处于动态变化之中.发酵结束后,少量的微生物和酶在陈酿阶段仍然残存在葡萄酒中,继续分解、代谢和转化葡萄酒中的成分.经过一段时间陈酿后,微生物和酶代谢底物基本被消耗殆尽,继续代谢其它的物质或副产物[3],这些持续不断的代谢活动引起葡萄酒颜色的变化.因此,葡萄酒陈酿期间颜色的变化起源于葡萄酒的发酵,一直延续到葡萄酒的陈酿,直至货架期.发酵结束后的陈酿期仍然伴随着漫长的各类微生物参与的生化反应过程,使葡萄酒处于动态状态——香气、色泽和口感等外部感官特征和内部成分之间的动态发展之中.
内生菌（Endophytic）是由外源微生物侵入并在长期的共生过程中形成的内生细菌、内生真菌和内生放线菌,一般不引起明显病害症状[4-5].内生菌作为重要的微生物,目前研究较多的是对葡萄中产白藜芦醇内生菌的筛选和特性的研究.白藜芦醇作为重要的酚类物质,与葡萄和葡萄酒中的色素类物质反应,可以改变葡萄酒的颜色[6-7]；内生菌除了产白藜芦醇之外,也产色素类物质或者与色素类物质结合或反应的相关物质,影响葡萄酒的颜色,究竟是哪一类内生菌产色素类物质,需要进一步研究.葡萄酒陈酿是一个多种微生物共存的复杂过程.葡萄酒颜色通常会随着陈酿明显降低,影响因素有哪些？内生菌如何影响葡萄酒陈酿期间颜色的变化？如何通过内生菌调节葡萄酒颜色的变化？需要科学系统地研究,揭示规律,趋利避害,保持葡萄酒的稳定.
我国各产区风土特点突出,四季分明、昼夜温差大,其独特的风土和自然环境条件在决定葡萄酒优良品质的同时,也极大地影响了葡萄酒颜色的变化.筛选和确定高产和稳定色素类物质的内生菌及其菌落构成,结合内生菌的次级代谢作用及其机理研究葡萄果实中各成分之间的转化、红葡萄酒酿造和陈酿期间代谢指标和颜色指标的变化对红葡萄酒颜色变化的影响,分析确定红葡萄酒贮藏期间颜色稳定的原因,最终揭示内生菌对红葡萄酒贮藏期间颜色的稳定性机理,为进一步研究奠定基础.因此,酿酒葡萄内生菌的筛选及其研究开发对于葡萄酒颜色的稳定和质量安全有重要的现实意义.
1 国内外研究现状及发展动态分析
葡萄及其产品葡萄酒主要由水、糖、酸、色素类、酚类、蛋白质、胶体、香气物质及矿物质等组成,这些物质之间相互溶解、分解、结合、转化,影响葡萄和葡萄酒颜色的变化.因此,葡萄和葡萄酒的颜色与这些成分息息相关.目前国内外相关的研究主要集中在以下几个方面：
1.1 内生菌的特性及功能
近年来,有关内生菌的研究主要集中在植物内生菌的多样性、影响寄主植物生理生化的内部机制、与寄主植物相互作用产生活性次级代谢产物的开发利用等方面.内生菌还能影响葡萄离体细胞的生理生化状态,但是不同内生菌的影响效应不同.
目前的研究发现,内生菌能产木质素酶、酚氧化酶、纤维素酶和漆酶等,分泌化感物质抑制其它植物生长,产生大量有机物并降解有害物质；产生多种抑制酵母菌和霉菌生长的有益物质和具有抑菌活性和化感作用的次级代谢产物及抗氧化物质.有些内生菌寄生在多种寄主体内,有些仅出现在某种或几种特定寄主体内,极少数几种具有寄主专一性.这些内生菌与寄主形成互利共生关系,诱导寄主植物产生高活性的次级代谢产物,同时提供活性物质,参与活性成分合成,转化次级代谢产物,为发掘新的生物活性物质奠定了基础.这些内生菌通过共生参与葡萄酒发酵和陈酿,产生各种生物活性物质,影响葡萄酒颜色的变化[8].
内生菌的菌群组成具有多样性.目前内生菌株筛选的目标主要是筛选产白藜芦醇的内生菌株[9].刘娅等[10]筛选出了高产白藜芦醇的内生菌C2J6,并确定为黑曲霉.曾芹等[9]从酿酒葡萄‘美乐’的葡萄皮、穗轴及果梗中筛选出产白藜芦醇的内生菌株,鉴定为链格孢属菌.因此,内生菌在产白藜芦醇方面有多样性.王朝霞等从烟台地区葡萄根部分离出了1331株19属内生菌,其中以镰孢属Fusarium （33.9%）、Ilyonectria （17.35%）和柱孢属Cylindrocarpon （15.7%）为优势菌群[11].在受污染的葡萄皮中也分离鉴定出了镰刀菌,并筛选了10个降解酶类,其中的聚半乳糖醛酸酶和木聚糖酶能够引起水果变质[12].前人通过形态鉴定、排重、ITS排序、系统树构建确定了酿酒葡萄的优势菌群为青霉、交链孢霉、镰刀菌,其中镰刀菌属的6株菌对3种指示菌均有抑制作用,具有抵抗酿酒葡萄病原真菌活性的作用[13].研究发现,嫩叶内生菌的分离率和多样性指数明显低于成熟叶和老叶,这些内生菌通过葡萄成熟采收进入葡萄酒,影响葡萄酒品质[14].Pamoda等[15]从仙人掌中分离的抗菌活性最强的镰刀菌属中分离的伊快霉素能够帮助寄主抵御胁迫环境,起保护色作用.除此之外,安荣艳等[16]也初步筛选鉴定出用于“人工贵腐酒”酿造的灰葡萄孢菌株,为后续研究奠定了基础.
内生菌的潜在危害也非常严重.多次传代后,内生菌的代谢产物不稳定、生物特性退化[17],引起葡萄酒颜色的严重退化,其机理需要进一步研究.内生菌种类和数量的变化会影响葡萄酒颜色的变化.综上分析,内生菌来源广泛,种类繁多,同一种内生菌能够产多种活性物质；有些内生菌具有正面作用,有些具有负面作用,因此内生菌具有保护葡萄酒和污染葡萄酒的双重作用,这与内生菌的作用机制有关.
1.2 内生菌与葡萄生长发育
“七分原料,三分工艺”.所以,葡萄酒品质主要由葡萄品质和酿酒工艺共同决定,而葡萄品质（葡萄中的糖、酸、酚类、蛋白质、维生素等成分）是决定葡萄酒品质的首要条件,影响其品质的因素主要有葡萄品种、环境条件、栽培措施等.因此,环境因子内生菌对葡萄品质有重要影响.内生真菌对葡萄叶片和果实中各生理生化指标也有影响,而且不同内生真菌的影响差异显著.
崔艳莉等[18]采用组织块培养法从‘赤霞珠’不同组织部位均分离到了内生酵母菌,初步鉴定为瓶形酵母（Pityros purom ）和克勒克酵母（Kleckera ）,为国产内生酵母菌的筛选鉴定奠定了基础.刘旭等[19]从染病葡萄植株的健康叶片中分离56株内生菌,从中筛选到对葡萄霜霉病（Plaopara viticola ）有明显拮抗效果的菌株,并初步将其中的CS5菌株鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus amyloliquefaciens ）,为葡萄霜霉病菌的生物防治提供了基础.王增福等[20]从酿酒葡萄植株的各组织中分离出的462株内生真菌中筛选出64株内生真菌.采用ITS排序、系统树构建确定了20个属酿酒葡萄内生真菌,其中包括3个优势种*链孢霉（Alternaria ）、青霉（Penicillium）、镰刀菌（Fusarium）；同时确定了对病原真菌有抗性的15个属,其中镰刀菌属的6株菌对3种指示菌均有抑制作用,是酿酒葡萄植株主要抗病原真菌的因素之一,这为葡萄生物抗菌研究提供了基础.申红妙等[21]采用电击转化法将含有GFP 基因的质粒pGFP78导入枯草芽孢杆菌JL4中,并成功得到表达GFP 的生防菌JL4-gfp ,同时采用叶片喷雾法接种、抗生素平板分离回收后发现,经过10次传代培养后的标记菌株对葡萄霜霉菌保持原有的抑菌作用；定殖在叶片内部14 d后检测不到接种菌株；喷雾3 d后的室内生防菌对葡萄霜霉病的防治效果达88.0%以上,但7 d后无明显防效.JL4-gfp 的定殖量与其防治葡萄霜霉病的效果呈正相关,这为明确枯草芽孢杆菌JL4在葡萄叶表面和内部的定殖情况,研究定殖与防治效果的关系提供了基础.马勉娣等[22]研究发现,再接种内生真菌改变了‘玫瑰蜜’葡萄叶片内生真菌的群落结构和分布,增加了‘玫瑰蜜’叶中内生真菌的数量和优势度,降低了内生真菌的多样性指数；喷施农药提高了内生真菌的多样性,但降低了内生真菌的分离率,表明再接种内生真菌能够改善葡萄叶片的健康状况,这对葡萄植株的生长和果实品质的改善有重要影响.黄治钰[23]将分离、筛选出的9株内生菌接种于‘玫瑰蜜’葡萄幼叶,果实成熟后内生真菌对叶面积及新梢节间大小无显著影响,但是不同菌株侵染显著改变了葡萄叶片中原有内生菌群结构；叶片总黄酮、总酚和还原糖含量显著降低,还原能力有所增强,VC含量有不同程度增加,总蛋白质含量有所降低；毛壳菌属（Chaetomium sp.）和炭角菌属（Xylaria sp.）能够提高果实的体积和质量、果穗的整体成熟度；果实中,毛科菌属使可滴定酸和总黄酮含量显著增加；炭疽菌属（Colletotrichum sp.）显著增加还原糖含量.康晶等[24]依次采用硫酸铵盐析、疏水相互作用层析及离子交换层析从黑曲霉YY-22发酵产酸果胶粗酶液中分离较高纯度的果胶裂解酶（PL）、聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶酯酶（PE）,结果表明,65%硫酸铵对PL回收率最大,分离出部分杂蛋白；经Phenyl-Sepharose FF疏水相互作用层析分离出PE,又经Q-Sepharose HP交换层析分别得到PG和PL,为进一步研究酶的基本性质及其在葡萄酒中的应用奠定基础.PL、PG和PE是葡萄中重要的三类酶,参与葡萄中重要色素类物质的分解和释放[25].这三类酶可以从黑曲霉YY-22中分离获得.因此,黑曲霉YY-22是参与葡萄中重要色素类物质分解和释放的重要内生菌.
总之,内生真菌可以在一定程度上改变葡萄叶片原有内生真菌的菌群结构,影响葡萄叶片和果实的生理生化状态及葡萄品质.这些内生菌及其影响效应随着葡萄酒酿造进入葡萄酒中,影响了葡萄酒发酵,甚至陈酿,这为进一步探讨内生真菌对葡萄酒的品质调控效应和机制奠定了基础.
因此,内生菌对葡萄叶片和果实的影响是非常显著的,一方面,内生菌随着发酵进入葡萄酒中,通过生化反应分解葡萄和葡萄酒中的成分影响葡萄酒的品质,另一方面,内生菌通过影响葡萄叶片和果实的成熟,影响葡萄中养分的积累,从而影响葡萄酒的品质.
1.3 内生菌与酚类物质的关系
1.3.1 葡萄酒中的色素类物质及其影响因素
葡萄酒中酚类物质对于葡萄酒品质至关重要.酚类物质具有促进和抑制葡萄酒氧化的双重功能[26].研究发现,在发酵和陈酿过程中,葡萄酒中的酚类物质相互聚合,或参与一系列复杂的生化反应,引起结构和含量的变化[27].花色苷分子小、溶解度高、不稳定,可以自聚,与辅色素共呈色,或与乙醇、糖、肽和单宁类物质反应[28].黄烷-3-醇类中的儿茶素、表儿茶素缩合成单宁在葡萄酒中聚合成原花青素,再与花色苷结合成聚合色素,酚酸（如咖啡酸、香豆酸等）与花色素和酒石酸结合,影响葡萄酒色度与颜色稳定性.山葡萄酒中加入葡萄糖氧化酶显著减缓总花色苷和二甲花翠素-3,5-双葡萄糖苷的降解速率[29].这些变化与花色素β环的羟基化形式有关.随β环羟基数目增加,蓝色会加深；而随β环化程度增强,红色也会增强[28],这与内生菌的作用密切相关.
陈酿期间酚类物质复杂多变.花色苷类赋予葡萄酒色泽,但是从陈酿开始缓慢下降[30],这与蛋白质、多糖和浓缩单宁的沉淀作用及其不可逆的、复杂稳定的花色苷衍生物有关,也与由花青素或黄烷三醇缩合成的聚合物花青素及其衍生物有关[31].游离花色苷降解或聚合色素导致酒体逐步由红紫色渐变为砖红色.游离花色苷能与多糖和肽反应,花色苷及其酰化物与其它酚类化合物形成结构复杂、稳定性较强的红褐色或聚合物,如吡喃花色苷和聚合色素.新葡萄酒中的花色素在陈酿期间结合成大分子缩合单宁,促进色素沉淀[32].溶解氧会促进其聚合及氧化降解[33].升温和酒瓶顶隙体积的增加不利于刺葡萄酒中酚类物质保存,尤其不利于原花青素保存.偏低或偏高的游离SO2均不抑制游离花色苷的氧化降解,但是不影响花色苷-单宁聚合物褪色.因此葡萄酒颜色受多种因素的影响.
乙醛作为键桥能使微氧促进花青素与儿茶酚或单宁聚合[34],降低单宁含量,避免SO2使花色苷脱色.微氧使乙醇和糖与花色苷反应,降低葡萄酒中总酚和游离花色素苷含量,提高酚类物质和颜色的稳定性[35].研究发现,微氧对葡萄酒中酰化花色苷的影响强于游离花色苷,提高了葡萄酒稳定性[36].因此,微氧能够通过控制游离花色苷含量明显控制葡萄酒中花色苷的变化.旧橡木桶陈酿的葡萄酒中游离花色苷含量比新橡木桶高,而新橡木桶中聚合花色苷的含量比旧橡木桶中高[37].因此,橡木桶自身的特性能够调节游离花色苷和聚合花色苷在葡萄酒中的比例,控制葡萄酒中花色苷的变化.
1.3.2 内生菌对葡萄酒颜色的影响
内生菌具有促进和抑制葡萄果实生长的双重作用.内生菌能够增加寄主对外界环境的应激耐受性、促进寄主植物生长及寄主中有效活性成分的合成[8].葡萄皮中的内生菌随着葡萄酒发酵进入葡萄酒,并长期贮存在葡萄酒中.
研究发现,米曲霉和米根霉发酵可以提高总黄酮含量[38],而蜗牛酶、纤维素酶、果胶酶对葡萄皮中总花色苷浸出率影响不显著,纤维素酶对绿原酸浸出率效果最好,蜗牛酶对白藜芦醇浸出率效果最好[39],但是对游离花色苷如二甲花翠素、花青素、儿茶素和表儿茶素等的浸出作用未见报道.这些酶类都是与内生菌有关的生物活性成分,参与葡萄酒中色素类物质或者相关物质的合成、分解和转化,因此也是葡萄酒颜色变化的重要因素.黄静等[40]研究发现,发酵中止后冷藏更有利于多数游离酚类物质的形成和提高.基于此,应综合考虑各个游离酚的性质,选择适宜的浸渍时间和贮藏温度,提高葡萄酒中酚类物质的含量,这与发酵工艺对游离酚和内生菌之间的相互作用有关.因此,内生菌对葡萄酒颜色的影响受多种因素的影响,研究这些因素对内生菌的多样性影响是目前的研究趋势.
酚类化合物可以通过促进或抑制酒酒球菌的生长和代谢影响二次发酵和葡萄酒的品质[41],酒酒球菌可以通过葡萄糖苷酶代谢花色素或者其它酚类化合物产生葡萄酒中重要的风味物质[42].这些微生物代谢和生化反应促进了葡萄酒的生长、成熟,也导致了葡萄酒的不稳定.因此,内生菌与酚类物质之间相互作用,影响葡萄酒颜色的变化.
1.4 内生菌的鉴定及分离方法
同位素示踪法是一种十分有效的分析和鉴定工具,应用范围非常广泛,速度快、准确度高,可以准确跟踪样品中某些成分的变化.目前,主要是利用同位素质谱仪技术示踪果实的生长状况,鉴定葡萄酒的真假、产地、酒龄和物质结构的变化.花色苷（总花色苷和游离花色苷）的化学性质非常活跃,利用示踪技术能够准确及时跟踪研究葡萄酒颜色的变化.有人利用同位素标记技术发现了内生菌与寄主之间存在着明显的共生关系.Fadwa等[43]用13C标记和液相色谱-质谱技术确定了葡萄酒中多种真菌毒素,这一技术具有高度可靠性和准确度,值得在内生菌筛选和特性研究中推广.也进一步证实花色苷与内生菌之间存在着密不可分的关系.
除此之外,抗药性标记法也成功的用于检测内生菌的定殖动态变化.通过目标细菌的自发突变或诱变,筛选出抗高浓度抗生素（如利福平、链霉素等）的突变体,再标记、回收、检测.吴蔼民等[44]用抗利福平法研究了内生菌73a的定殖消长动态.蔡学清[45]用双抗标记检测到枯草芽胞杆菌BS-2和BS-1的定殖动态.除了抗药性标记法外,还有免疫学方法,如酶联免疫吸附法（ELISA）、荧光抗体技术、Western印迹法、基因标记法、特异性寡核苷酸片段标记法等也广泛应用于内生菌检测.目前,GFP 使内生菌检测更加快捷,由于宿主生活环境多样性以及内生菌与宿主关系的复杂性,有关内生菌定殖和分布的情况目前都是同时采用多种研究技术综合分析.
2 结论
综上所述,内生菌的来源和种类非常丰富.酿酒葡萄蕴含丰富的内生菌资源和活性物质.葡萄果皮、果梗中的酚类物质,尤其是色素类物质通过发酵转移到葡萄酒中,再经过陈酿相互转化、合成,影响葡萄酒颜色的变化,而其中的内生菌随着发酵进入葡萄酒,影响葡萄酒中与颜色有关的物质的变化.一方面可以提高寄主抗逆性,提供有益的活性化合物,另一方面威胁了食品安全,具有双重作用.
基于以上研究分析,内生菌对葡萄酒的颜色有非常重要的影响,具有广泛的研究价值,非常有必要开展关于葡萄酒中内生菌的筛选、鉴定、多样性及对葡萄酒颜色影响机理的研究.
3 展望
葡萄酒作为一种世界性的特殊饮料食品,其品质的优劣影响到消费者的喜好,其安全性影响到消费者的身心健康和葡萄酒的推广.颜色作为葡萄酒品质的一个重要参考指标,不但影响到消费者的感官评定,而且其酚类成分自聚或与其它物质结合发生转化,影响葡萄酒的品质.只有颜色稳定的葡萄酒才是安全的,其品质才能得到保障.目前对于葡萄酒颜色的科学研究主要集中在利用内生菌调节葡萄在生长期间色素类物质的变化,采取各种措施获得澄清的葡萄酒,提高和稳定葡萄酒中的色素类及与色素类物质变化有关的酚类、香气物质、pH值和酒度等成分含量方面,及控制酵母菌、细菌、乳酸菌和醋酸菌等内生菌群体数量（这方面研究绝大多数集中在筛选和鉴定上,进一步的研究非常缺乏）,这些成分和内生菌往往具有双重作用,并且也没有更详细的理论研究.除此之外,聚合、分解、化合或转化等作用导致了葡萄酒各成分之间的不平衡——直观地体现在葡萄酒的颜色、香气和口感之间的不平衡.大量事实证明,内生菌使生物转化复杂化,是聚合、分解、化合或转化等作用的推动力,这加剧了葡萄酒颜色的变化.我国各葡萄酒产区生态特点独特,内生菌菌群复杂多样,引起了葡萄酒颜色丰富多变的同时,也引起了葡萄酒其它风味成分的变化.因此,颜色的变化会带动葡萄酒整体结构和成分的改变.基于此,需要借助科学手段探索引起葡萄酒颜色变化的根源及其机制,有助于我们因地制宜地采取科学措施稳定葡萄酒颜色,保障葡萄酒的品质与安全.因此,对于葡萄酒颜色变化的研究具有显著的科学和实践意义,对其质量与安全的评价是未来科学发展的必然趋势.
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此文总结：此文为关于葡萄和葡萄生长发育和内生菌方面的生长发育论文题目、论文提纲、生长发育论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文.
平衡施肥对大豆和玉米生长发育与产量的影响
摘要平衡施肥能改善作物的各项生理指标,增加作物产量 通过对田间平衡施肥试验结果分析,明确了平衡施肥在农田退化土壤治理中对作物生长发育的影响和重要作用 关键词平衡施肥；大豆；玉米平衡施肥技术是以养分归还.
低温水灌溉对花生生长发育和产量的影响
摘要 花生是我国农业生产中的重要经济作物,但是对以往花生生产的调查发现,花生种植人员经常应用低温井水对花生植株进行灌溉,这种灌溉方式对花生生长造成了不良影响,影响了花生产量与品质 本文就低温水灌溉对花.
幼儿营养状况对幼儿生长发育的影响
王 威1 ,王国刚 2 ,窦 建 2（1 四川幼儿师范高……专科学校,四川 江油 621709；2 西南医科大学附属叙永县人民医院,四川 泸州 646400）摘 要目的探讨分析幼儿营养状况对幼儿生.
内生菌对食品资源品质的影响
摘 要内生菌普遍存在于植物类食品资源中,不仅对宿主植物的生长、代谢、抗逆……起着重要调节作用,而且对植物食品中功效成分合成产生重要影响 将功效性的植物内生菌开发成制剂,用于提升食品资源品质、提高农产品.