口蹄疫病毒分子生物学诊断方法进展,该文是分子生物学有关毕业论文格式范文和分子生物学和口蹄疫和研究进展类本科论文范文.
分子生物学论文参考文献：
■文/ 山东绿都生物科技有限公司 于新友 李天芝
摘 要 文章论述了口蹄疫病毒分子生物学诊断方法,包括基因芯片检测方法、常规RT-PCR 方法、多重RT-PCR 方法、荧光定量RT-PCR 方法、环介导等温扩增技术、核酸试纸检测技术、赖解旋酶恒温基因扩增技术等7 种方法,对口蹄疫的诊断和防控有一定的参考价值.
关键词 口蹄疫病毒；分子生物学；诊断
口蹄疫(foot and mouth disease,FMD) 是由口蹄疫病毒(foot andmouth disease virus,FMDV) 引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病,可感染猪、牛、羊等70多种动物[1].该病于1514 年首次发现于意大利,目前,在非洲、亚洲、南美洲及欧洲的部分国家广泛流行.该病传染性强、传播快、流行范围广,且能以气溶胶的形式远距离传播,一旦发生,往往造成大流行,不易控制和消灭,不仅给畜牧业造成巨大的经济损失,还影响社会稳定、国际贸易及国家声誉.我国是世界上口蹄疫多发国家之一,且疫情复杂,这与我国的地理环境密切相关,邻国如越南、缅甸、泰国等国都有口蹄疫流行.世界各国对口蹄疫的防控都十分重视,此病已成为国际重点检疫对象.世界动物卫生组织(OIE) 将口蹄疫列在15个A 类动物疫病之首,我国政府也将其排在一类动物传染病的第一位.口蹄疫一年四季均可发病,多发于冬、春寒冷季节[2].本文就口蹄疫病毒的分子生物学诊断方法研究进展进行综述,以期为口蹄疫的快速诊断和防控提供参考.
1 分子生物学诊断
1.1 基因芯片检测
基因芯片检测技术是在芯片上排列着众多一定碱基顺序的DNA 探针,通过与碱基互补序列的单链目标DNA 片段杂交,捕捉相应的DNA 分子.检测系统再将杂交过程或结果转化为可观测的信号,进入信号采集分析系统[3].杨林等[4] 根据FMDV 基因组序列保守区,设计合成2 对引物,通过RT-PCR 方法筛选出特异引物,用Cy3 标记下游引物5′端,针对这个基因片段,设计合成4 条寡核苷酸探针,开展靶基因扩增和克隆、阳性质粒构建、芯片杂交与反应条件优化以及芯片灵敏度和特异性分析等试验研究,建立FMDV 的基因芯片检测方法.相磊等[5] 为建立FMDV 不同血清型与基因型的基因芯片检测方法,设计针对O 型8 个基因型、A 型3 个基因型和亚洲1 型的特异性探针.从美国GenBank 与英国世界口蹄疫参考实验室基因库下载了O 型、A 型和亚洲1 型FMDV 的VP1 基因序列547 条.对每一种血清型序列用DNA Star 软件ClastalW 程序进行多重比对,做系统发育分析并进行基因分型.用生物学软件BioSun 2.0 建立基因型数据库,设计每一基因型的特异性探针.共设计出104 条候选探针,通过芯片试验筛选出12 条特异性探针.以各型特异性探针所对应的靶序列模板做10 倍系列稀释进行PCR 扩增,扩增产物与探针杂交,验证各探针的灵敏度.对O型SEA、Euro-SA、ME-SA、WA4个基因型的各条探针的灵敏度进行了检验,结果这些探针能够检测到102数量级拷贝数的阳性靶标.
1.2 常规RT-PCR 方法
RT-PCR 方法是根据目的片段序列设计引物,借助仪器和相关聚合酶体外大量扩增部分或全部目的片段,是一种快速、简便、特异的诊断方法.张书光等[6] 设计合成一套引物,通过反应条件的优化,建立了一种RTPCR的方法,用于检测O、A 和亚洲I 型口蹄疫病原,并用该法检测患病猪的颌下淋巴结和扁桃体,牛、羊的食道- 咽分泌物(O-P 液) 等样品.结果表明,该方法可快速灵敏检测出猪的颌下淋巴结和扁桃体,牛、羊的食道-咽分泌物中的FMDV,并具有较好的特异性和重复性.结论：建立了一种RT-PCR 检测O、A 和亚洲I 型口蹄疫病原的方法.
1.3 多重RT-PCR 方法
多重RT-PCR 具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点,是在同一反应体系中,加入多种引物,同时检测2 种或2 种以上的病毒RNA,目前已广泛应用于临床疾病的快速诊断.张彦婷等[7] 根据口蹄疫病毒VP1 基因序列,利用Primer Premier 5.0 软件设计4 条特异性引物,通过对退火温度等反应条件进行优化,建立能够同时扩增出O 型、A 型、Asia-1 型口蹄疫病毒的多重RT-PCR 检测方法.结果表明,建立的方法最低可以检测出约含1pg/μL 的病毒样品,该方法对猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等其他相关病毒的检测结果均为阴性,特异性良好.秦敏等[8] 针对蓝舌病病毒(BTV)NS3 基因、FMDV 3D 基因、小反刍兽疫病毒(PPRV)N 基因和水疱性口炎病毒(VSV)N 基因序列设计引物,优化反应体系和扩增条件,建立了一种同时检测4 种病毒的多重PCR 方法.对建立的多重PCR 检测方法的特异性及敏感性进行检验,结果表明建立的多重PCR 检测方法敏感性强、特异性良好,对4 种病毒的最低检出限分别为PPRV 103copies/μL、BTV 103copies/μL、VSV 103copies/μL 和FMDV 102copies/μL.
1.4 荧光定量RT-PCR 方法
荧光定量RT-PCR 技术是指采用SYBR Green Ⅰ荧光染料或荧光探针通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量,不需要分离扩增产物,即能准确定量起始模板数[9].李金海等[10] 根据FMDV 聚合酶3D 基因序列比对结果,设计特异性引物和MGB探针,建立检测FMDV 的一步法荧光定量RT-PCR 检测方法.结果显示,该法能特异性检测A 型、O 型、Asia1型FMDV,而对猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎病毒等检测结果均为阴性,构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL,检测病毒RNA 的敏感性可达7.1fg/μL,比多重RT-PCR 敏感性高10 倍,对4 份样品进行5 次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%.王乃福等[11] 根据口蹄疫病毒3D 蛋白编码基因、水疱性口炎病毒N蛋白编码基因和猪水泡病病毒VP1 蛋白编码基因的高保守区设计特异性引物和探针,对3 种动物病毒进行多重荧光定量RT-PCR 扩增.结果经过扩增,可以同时检测口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒和猪水疱病病毒,而其他参试病原均无扩增信号,显示其良好的特异性.对口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、猪水疱病病毒的最低检测限分别达到101、102、102 个质粒拷贝浓度.宋爽等[12] 根据高度保守的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) 的5´UTR 基因、牛传染性支气管炎病毒(IBRV) 的gB 基因和FMDV 的3D 基因,分别设计了3 对对应的特异性引物和3 种不同发光基团标记的TaqMan 探针,建立了同时检测这3 种病毒的多重荧光定量PCR 的方法.并对其反应条件进行优化.结果表明,该多重荧光定量PCR 方法能够特异性检测出BVDV、IBRV 和FMDV,而对BTV 等检测结果均为阴性,对BVDV、IBRV、FMDV的最低检测量分别为194copies/μL、208copies/μL 和150copies/μL.而且组内和组间变异系数均低于0.85%.
1.5 环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术(LAMP) 是在等温条件进行扩增反应.基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率和特异性高,可在15~60min 扩增109~1010 倍,可只通过扩增产物的有无来判别.秦智锋等[13] 设计了6 条针对FMDV 3D 基因的8 个位点的特异性引物,建立了口蹄疫病毒RTLAMP检测方法的.所建立的检测方法灵敏度高,与实时荧光RT-PCR 灵敏度相当,且具有特异性,对其他水疱性疾病病原体检测均为阴性,而且简单,不需要复杂的仪器,常规水浴锅在63.5℃即可进行,肉眼可直接观察检测结果.李健等[14] 利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP),建立了口蹄疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性.结果表明,根据蹄疫病毒多聚蛋白基因保守区段设计的LAMP 引物能够在65℃下,1h 内实现目标核酸区段的大量扩增,检测结果可直接用肉眼判断.该检测体系具有极高的特异性,只能检测到目标病毒,与其他类似病毒如猪水疱病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒等无交叉反应,可检测到10-5 稀释度的目标病毒核酸量,比普通RTPCR的灵敏性高100 倍,比荧光PCR高10 倍.
1.6 核酸试纸检测技术
核酸试纸检测技术是将核酸探针标记与试纸条相结合进行生物学检测,是核酸检测的新领域.龚真莉等[15] 用RT-PCR 方法获得FMDV3D 核苷酸片段,在引物中设计了灵敏度高、特异性好的核酸探针- 生物素和地高辛,使扩增产物结合探针.利用胶体金的放大原理将链霉亲和素与金颗粒形成胶体金混合物,从而与RT-PCR 产物中的生物素探针结合.硝酸纤维素膜上端标记生物素化山羊抗兔IgG 作为指控条带,下端标记抗地高辛抗体以捕获RT-PCR 产物中的地高辛探针.组装金标试纸条,检测RT-PCR 产物,结果表明该核酸试纸条可以检测到0.3×10-3~3×10-3μg/μL,敏感性高于琼脂糖凝胶电泳,两种方法的符合率高.
1.7 赖解旋酶恒温基因扩增技术
赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA) 是一种新兴、简单、有效的基因扩增技术,其扩增原理是先用解旋酶解开双链DNA,再依靠单链DNA结合蛋白(SSB) 与模板单链结合,使模板单链处于单链状态并保护它的完整性,引物与模板杂交,然后在DNA聚合酶催化下扩增.新生成的dsDNA产物作为底物进入下一轮扩增[16].金静维等[17] 针对FMDV 编码3D 蛋白(RNA 聚合酶) 的保守序列设计特异性引物,建立了FMDV 逆转录解旋酶恒温扩增技术(RT-HDA)快速检测方法.该方法可在65℃下,120min 内实现对口蹄疫病毒保守序列的大量扩增.该方法可检测到0.2ng 的FMDV 核酸量,比普通RT-PCR 高10 倍,具有极高的特异性,除了能对FMDV 核酸进行扩增外,对其他临床症状与口蹄疫类似的病毒,如水疱病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和水疱性口炎病毒的核酸,则不能扩增出目的片段.
2 小结
口蹄疫防控工作是一项涉及畜牧业安全生产的大事,也是保障人们食品安全和国家声誉的重要问题.目前,我国是疫区国家,国内及周边疫情都很复杂,口蹄疫的防控形势仍比较严峻,口蹄疫的正确诊断是进行防控的前提和基础,因此,建立早期、快速而准确的检测方法从而采取相应的防控措施才能控制口蹄疫的流行.目前已经建立了FMDV 多种分子生物诊断方法,但这些方法各有利弊,如基因芯片检测技术优点是一次可检测大量样品和大量疾病,检测速度快、灵敏度高,缺点是一次性需要大量的资金投入,费用高,不适合基层实验室应用,且特异性不高,容易出现假阳性.常规RT-PCR 方法虽然检测速度快、特异性强,但不能准确定量,且敏感性有限.荧光定量RT-PCR 方法虽然克服了常规RT-PCR 的缺陷,但仪器和探针的合成昂贵,检测成本比较高,不适合大面积推广应用.LAMP 方法虽然简单、方便,适合基层进行推广应用,但灵敏度太高,易出现假阳性结果.文中提到的核酸试纸检测技术,需要对样品进行PCR扩增,且需要对样品进行纯化,对技术要求较高,基层部门不易掌握.随着分子生物学技术的不断发展,笔者认为恒温基因扩增技术与试纸检测技术结合进行检测是未来分子检测技术发展的新方向,目前对其他疾病的检测方面已经研制出了基因试纸卡检测盒,是将LAMP 检测与试纸检测技术相结合的新技术,兼具二者的优点,操作简单,全程时间短,又能避免假阳性的出现,不需要冷冻保存,易保存和运输,适合基层兽医部门应用,基因试纸卡及其配套适合携带的简易核酸制备设备是未来口蹄疫检测试剂的研究方向.■
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猪腹泻性病毒病荧光定量PCR鉴别诊断方法进展
■文 山东绿都生物科技有限公司 于新友 李天芝摘 要 荧光定量PCR 方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速高效、定量准确、全封闭反应……优点,越来越受到广大兽医相关工作者的关注,在动物疾病诊断中.
猪口蹄疫和猪蹄裂病的鉴别诊断
王小刚（河北省承德市兴隆县农牧局,河北承德067300）摘要猪口蹄疫在每年的秋冬季节多发,疾病的典型症状发生在蹄部,猪蹄裂病的高发季节也是在秋冬,疾病的临床症状也表现在蹄部,因此,经常混淆口蹄疫和蹄裂.
猪口蹄疫的发生、诊断和综合防控措施
摘要猪口蹄疫是国家农业部公告中的一类传染病,为人畜共患病 该传染病以发病急、高热、高度接触性传染为特点 目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型,我国目前流行的主要是“0”型和亚洲.