米曲霉酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）的克隆,本文是米曲霉有关论文范文数据库和曲霉和克隆和辅酶方面学年毕业论文范文.
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摘 要：酰基辅酶A 结合蛋白（ACBP）通过参与酰基辅酶A 的代谢和参与脂肪酸的代谢过程,进而影响酱油的风味物质——酯的代谢.本实验从培养不同时段的米曲霉A100-8 中提取总mRNA,通过逆转录和PCR技术扩增酰基辅酶A 结合蛋白基因（ACBP）.经过连接、转化和蓝白斑筛选以及双酶切验证,最后进行测序,结果正配率达到99%, 为研究和改良酱油的风味物质提供了分子理论基础.
关键词：酰基辅酶结合A 蛋白；米曲霉；PCR 技术
中图分类号：Q943
酱油生产中常用的霉菌,分别有米曲霉、黄曲霉、黑曲霉等,同时耐盐酵母和乳酸菌也是近几年国内外厂商会选用的酿造酱油的菌种.其中米曲霉产生的酶系十分丰富,主要包括淀粉酶、蛋白酶、肽酶、果胶酶、转化酶、谷氨酰氨酶、脂肪酶、纤维素酶及麦芽糖酶等[1].酱油的香气,主要是由酯类构成,而酯类是由醇类和酸类通过酯化反应生成[2].由于参加反应的醇类和酸类在发酵过程中其种类和含量的动态变化,导致酯类丰富多样[3],最终反映在酱油香气的差别上.
酰基辅酶A 结合蛋白是一种小分子量的多肽,它通常是用来连接长链酰基辅酶A 的一种蛋白质.植物酰基辅酶A 结合蛋白家族蛋白能调节植物生长并促进植物种子油脂的形成[4],并且参与了多种细胞功能的活动,其中包括脂肪酸生物合成的调控,酶活的调节,细胞内酰基辅酶A 量的调节,为β 氧化提供酰基辅酶A 结合复合物的运输,参加复杂油脂的合成,发挥基因的调控作用[5].目前,对ACBP 研究的重点主要集中在以下两点.① ACBP 参与酰基辅酶A 的代谢.由于ACBP 是束状蛋白,而酰基辅酶A 的结合位点恰恰位于其疏水基团表面,所以ACBP 对饱和及不饱和的中长链酰基辅酶A 都有很高的结合性.在两个酰基辅酶A 合成时,用ACBP 作为一个支架来测量游离酰基辅酶A 的浓度的实验中,用半胱氨酸荧光标记物FACI-24 和FACI-53 代替牛的Met24 和Ala53 标记的ACBP.经过测量游离酰基辅酶A 浓度以及酰基辅酶A合成酶的活力,发现酰基辅酶A 感受器具有更高的敏感性.② ACBP 参与脂肪酸代谢过程.ACBP 参与酰基辅酶A 的代谢过程,而长链的酰基辅酶A 作为中间产物在脂肪酸合成和降解过程中发挥了重要作用,它可以作为脂类合成的中间体,还可以作为信号分子行使各种生理职能.Lance Lee 等人的试验表明,ACBP 是用于连接长链脂肪酸酰基辅酶A 的最好的蛋白,并且在脂肪酰基辅酶A 运输和对其数量的控制方面起着重要的作用；ACBP 的缺失造成脂肪酸的新陈代谢不正常.
Yuchenko 等人则证实了甘蓝型油菜的ACBP 提高了酰基辅酶A 和磷脂酰基的交换率.以上事实证明了酰基辅酶A 结合蛋白参与了生物体的脂肪代谢.在用胰岛素诱导脂肪细胞系的生长和分化过程中,发现细胞内酰基辅酶A 结合蛋白及其mRNA 的含量明显提高,说明酰基辅酶A 结合蛋白在脂类的生成中发挥了重要的作用.
动物、植物和微生物都可利用乙酰CoA 合成自身所需要的脂肪酸.其中草酰乙酸和乙酰CoA 通过缩合成为柠檬酸,再依次进行下去,合成脂肪酸.因此,凡是在体内代谢能够生成乙酰CoA 的物质（如糖、蛋白质等）都是脂肪酸合成的碳源.通过调节米曲霉中的脂肪酸代谢途径来改善酱油风味的技术是一种高效的方法,关于ACBP 及酱油中米曲霉风味物质代谢,国内外都没有涉及这方面的研究.本研究从培养不同时段的米曲霉A100-8 中提取总mRNA,通过逆转录和PCR 技术扩增酰基辅酶A 结合蛋白基因.经过连接、转化和蓝白斑筛选以及双酶切验证,最后进行测序,以期为研究和改良酱油的风味物质提供分子理论基础.
1 材料与方法
1.1 实验材料
米曲霉A100-8,取自天津科技大学菌种保藏室.
1.2 方法步骤
提取培养了不同时间段的米曲霉A100-8 的总mRNA,进行逆转录合成cDNA,设计出引物后,应用不同时间段的cDNA 进行探索,找到最适宜模板,利用PCR 技术进行扩增,凝胶电泳进行测定并切胶回收.将目的基因与载体连接,将重组的质粒导入大肠杆菌感受态细胞进行转化.蓝白斑过夜培养,挑取白斑.再利用PCR 技术进行大量扩增,电泳回收产物并进行测序,以验证实验结果.
2 结果与分析
2.1 Trizol 法提取总mRNA
图1 是提取总mRNA 电泳图,三条条带从左至右是分别是选取培养了30 h、36 h、42 h 的米曲霉A100-8菌种,通过用Trizol 法提取总mRNA,通过琼脂糖凝胶电泳,检验提取总mRNA 的效果.从图1 中可以观察到28S 和18S 的总mRNA 带型清晰, 表明mRNA 较为完整,可以将其进行逆转录为cDNA,以用作模板进行PCR 扩增试验.
2.2 引物设计
ACBP 基因片段大小为1 098 bp, 根据GenBank（AJ421525）报道的ACBP 基因序列利用引物设计软件Premier 5.0,设计上、下游引物.
在上游引物的5’末端加入酶切位点EcoRI 和保护碱基CT 以及在下游引物的5’末端加入酶切位点Sal I 和保护碱基AT.
引物设计得到的上下游引物为：
SENSE 5’- CTgaattcATGTCGGACTCTGTGGATC-3’ANTI SENSE 5’- ATgtcgacCTAGGGGCATTTATGTACC-3’
2.3 PCR 法扩增ACBP 基因片段
用培养了42 h 的米曲霉A100-8 来提取总mRNA,进行逆转录合成cDNA,以该cDNA 作为PCR反应模板,分7 组设置PCR 温度梯度分别为52 ℃、52.6 ℃、53.7 ℃、55.3 ℃、57.4 ℃、59.1 ℃、60 ℃.根据片段大小采用2K 的Maker,跑电泳结果显示,在52.6 ℃、53.7 ℃温度条件下,在1 100 bp 附近有微弱的条带,同时在53.7 ℃温度条件下,在1 300 bp 处也有条带,应当是含有内含子片段,其他温度条件下,只有在1 300 bp 处有明亮的条带,表明几乎全部混有内含子.52.6 ℃温度条件下为预期想要的结果,但由于条带过浅且经多次试验发现,其结果非常不稳定.考虑到提取总mRNA 阶段,可能由于Trizol 加量不足导致提取的总mRNA 有DNA 污染.导致实验结果受含有内含子的片段（内含子的片段大小为1 306 bp）影响较大,所以改用提取完总mRNA 后用DNA 酶进行消化,以去除可能混有的DNA.
根据上一步实验得出的结论继续摸索反应条件,三组分别采用培养了30 h、36 h、42 h 米曲霉A100-8来提取总mRNA,再经DNA 酶消化后进行逆转录合成cDNA,以该cDNA 作模板进行PCR 扩增后跑电泳,观察得知只有第二组在PCR 培养了36 h 的反应温度分别为52 ℃、53.9 ℃、55 ℃,35 个循环时出现了较为明显的条带.
经过多次试验摸索,确定PCR 条件,模板为用培养米曲霉A100-8 菌株36 h 的总mRNA 经DNA 酶消化后进行逆转录合成的cDNA,PCR 最适宜温度为53.5 ℃,循环35 次.在该条件下继续验证.PCR 扩增后跑电泳,发现条带清晰,结果稳定,经过PCR 大量扩增并胶回收,可再进行后续的反应.
2.4 连接、转化后进行蓝白斑筛选
本实验中,利用DNA 连接酶将ACBP 基因片段与T 载体连接在一起,成为一个完整的重组质粒,再通过CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞,将外源DNA 分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状,并完成大肠杆菌的转化.
蓝白斑筛选的原理是野生型大肠杆菌（E.Coli）产生的β- 半乳糖苷酶,可以将无色化合物X-gal（5- 溴-4- 氯-3- 吲哚-β-D- 半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝色的物质5- 溴-4- 靛蓝.5- 溴-4- 靛蓝可使整个菌落产生蓝色变化.当插入外源基因后,突变型大肠杆菌的β 半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断,无法形成完整的β 半乳糖苷酶,故不能对无色化合物X-gal 进行切割,菌落呈白色.蓝白斑数量适宜且白斑附近的卫星菌落较少,由于当外源DNA插入质粒的多克隆位点后,几乎不可避免地产生无α- 互补能力的氨基端片段,使带有重组质粒的细菌形成白色菌落,因此可初步认为,白色菌落内插入了质粒.可挑取没有卫星菌落且长势良好的白色菌落,由1 号到10 号进行标记,进行培养过夜,以备用做菌落PCR,进行进一步确认.
2.5 菌落PCR 进行验证
将1-10 号菌落作为PCR 模板进行菌落PCR 反应.结果显示,1-10 号菌落经PCR 反应后,均在1 100 bp附近出现了较为清晰的条带.说明用T 载体进行连接后在大肠杆菌感受态细胞进行转化的效率较高.
2.6 双酶切验证
根据《内切酶在不同缓冲液里的活性表》,选取能让两种酶EcoRI 和Sal I 同时作用的最佳缓冲液.最终选择了共用的缓冲液10×H Buffer,以保证100% 的酶活性.T 载体大小3 016 bp,目的片段大小为1 098 bp.在1 100 bp 和3 000 bp 附近出现了较为明亮的条带,证明T 载体上所连片段大小与目的片段大小一致,可作进一步测序验证.
2.7 测序
选取结果相对较好的2 号、3 号、8 号、9 号菌落在无菌条件下接种到培养基中进行培养,以用作测序.其中8 号的测序结果为：
>1c1|4131
Length等于1275
Score等于2017bits (1092), Expect等于0.0
Identities等于1096/1098(99%),Graps等于0/1098(0%)
Strand等于Plus/Plus
3 结论
研究从米曲霉中克隆出酰基辅酶A 结合蛋白基因,为后面它在大肠杆菌中高效表达提供了基因基础.获得了没有DNA 污染的总mRNA；PCR 获得了大小正确的ACBP 基因片段；将目的基因连接、转化到大肠杆菌感受态细胞内,通过蓝白斑筛选、菌落PCR 和双酶切进行验证；测序结果显示有99% 的同源性,表明已获得正确的ACBP 基因片段；为其在脂肪代谢中的区位相关实验做准备,最终明确米曲霉脂肪代谢对酱油风味的影响,对酱油的工业生产具有重要的理论意义和应用价值.
参考文献：
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