高效液相色谱检测猪肉盐酸克伦特罗的方法优化,本文是检测类论文范文文献和盐酸克伦特罗和高效液相色谱和猪肉方面论文范文文献.
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摘 要：通过对样品前处理方式、色谱仪器条件的优化研究改进了高效液相色谱测定猪肉中盐酸克伦特罗的方法.采用高氯酸一步提取法并补充正己烷脱脂步骤,应用混合阳离子交换柱净化提取液,可有效去除杂质,避免干扰；色谱流动相选择硫酸铵+ 甲醇+ 乙腈体系,检测波长210 nm,峰形良好.验证表明改进后的方法线性范围为0.01 ～ 0.5 μg/mL,线性相关系数r等于0.9994,峰面积RSD 为1.47%,加标回收率达90.88%.本方法前处理过程简化,分析时间缩短,适合于盐酸克伦特罗含量的快速、准确测定.
关键词：高效液相色谱；盐酸克伦特罗；猪肉；前处理
中图分类号：TS207.5
我国国家标准及行业标准对猪肉中的盐酸克伦特罗色谱检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）法[1]、气相色谱- 质谱（GC-MS）法[2]、高效液相色谱- 串联质谱（HPLC-MS/MS）法[3-5] 等.高效液相色谱法不需要气相法所必需的衍生步骤,利用克伦特罗中等极性物质的特点,可应用C18 反相色谱柱实现直接分离检测,精密度高、假阳性低,而且设备投资相比质谱法要低很多,是大部分基层检验机构的猪肉盐酸克伦特罗检测首选方法.
利用高效液相色谱法检测猪肉中盐酸克伦特罗残留的唯一国标是GB/T 5009.192-2003,前处理方法较为复杂,需要进行提取、萃取、净化等多步处理过程,其操作繁琐、耗时长.与之相比,液质法行业标准SN/T 1924-2011 的前处理方法简洁高效,能力验证结果的合格率达到100%,远高于GB/T 5009.192-2003 法[6],这足以说明优化前处理步骤不仅可以提高实验效率,检测结果同样满足检出限和准确度要求.本实验在这两个标准方法基础上,对样品前处理方式进行优化,采用聚合物基质混合型阳离子固相萃取柱净化对猪肉中盐酸克伦特罗高效液相色谱检测进行研究,建立适合基层检验机构的猪肉中盐酸克伦特罗批量检测方法.
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
猪肉原料：市售.
试剂：盐酸克伦特罗标准溶液（100 μg/mL）,农业部天津环保监测研究所；乙腈、甲醇、正己烷（均为色谱纯）,DIKMA 公司；盐酸、高氯酸、硫酸铵、氨水（均为分析纯）,天津市凯通化学试剂有限公司；超纯水,实验室自制.
1.2 主要仪器
Agilent1260 高效液相色谱系统（配置DAD 检测器）,美国安捷伦科技有限公司；Venusil XBP C18（L）色谱柱、Cleanert PCX 固相萃取柱（60 mg/3 mL）,天津博纳艾杰尔科技有限公司；高速匀浆机,德国IKA 公司.
1.3 仪器条件
色谱柱为Venusil XBP C18（L）柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）.流动相：0.02 mol/L 硫酸铵 + 甲醇 + 乙腈（体积比70 ∶ 25 ∶ 5）.柱温：35 ℃.二极管阵列检测器检测,检测波长：210 nm.流速：1.0 mL/min.进样量：20 μL.
1.4 标准工作溶液的配制
用甲醇将标准溶液稀释成浓度为1 μg/mL 的盐酸克伦特罗标准溶液作为储备液.
盐酸克伦特罗标准工作溶液：临用前用流动相将盐酸克伦特罗标准储备液稀释成浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.3 μg/mL 和0.5 μg/mL 的对照溶液,供高效液相色谱分析.
1.5 实验方法
1.5.1 提取
称取10&plun;0.01g 试料, 用0.1 mol/L 高氯酸溶液20 mL 匀浆,置于50 mL 离心管超声振荡20 min 后,5 000 r/min 离心15 min,收集上清液于另一50 mL 离心管,加入20 mL 正己烷,振荡均匀.5 000 r/min 离心5 min,弃去正己烷及乳化层,水相溶液立即经滤纸过滤,并用2 mL 0.1 mol/L 高氯酸溶液洗涤滤纸,收集全部滤液,待净化.
1.5.2 净化
Cleanert PCX 固相萃取柱依次用3 mL 甲醇、3 mL水和3 mL 0.1 mol/L 盐酸活化；然后取10 mL 样品液上样至固相萃取小柱中,控制流速约为每分钟10 滴；依次用3 mL 水和3 mL 甲醇淋洗柱子.淋洗完全后,真空抽干Cleanert PCX 小柱5 min,再用5 mL 5% 氨水甲醇溶液洗脱,洗脱液在40 ℃氮气吹干,用1 mL 流动相溶解残渣,0.22 μm 滤膜过滤后,在仪器工作条件下测定.
1.5.3 测试
以标准溶液色谱峰的保留时间为依据进行定性分析,利用峰面积进行多点标准曲线拟合,外标法定量计算.
2 结果与讨论
2.1 色谱条件选择
按照GB/T 5009.192-2003 方法二中流动相采用水- 甲醇（V 水/V 甲醇等于55/45）进行了标准溶液进样,实验结果没有标样峰.吴林阳[7]、朱晓艾[8] 对国标法的改进采取了缓冲盐 + 甲醇 + 乙腈的流动相体系,实验结果取得了良好的精确度和回收率,参考这些文献并结合阳高检验检测中心的仪器设备状况,研究对比了不同缓冲盐及不同流动相比例的标准溶液出峰情况,最终确定流动相为0.02 mol/L 硫酸铵 + 甲醇 + 乙腈（体积比70 ∶ 25 ∶ 5）,检测波长210 nm,流速1.0 mL/min,进样量20 μL,柱温35 ℃.在此色谱条件下,如图1所示,盐酸克伦特罗标准溶液及加标样品色谱图目标峰峰形良好,出峰位置附近无杂质峰,有利于定性判定和定量计算.
2.2 提取方式优化
GB/T 5009.192-2003 方法中盐酸克伦特罗提取要经过稀酸溶液提取、碱性条件下反萃取、浓缩、再酸化的复杂步骤,其根本目的在于有效去除蛋白质和碱不溶性杂质,减小基质干扰,但复杂的过程不仅使实验效率相当低下,而且牺牲了目标提取物的回收率,可谓得不偿失.
而且,该方法中没有涉及去脂的步骤,肌肉样品仍然含有脂肪成分,如果不做针对性去除,不仅会影响后续的净化过程,还会导致色谱检测的基质干扰,降低回收率.
出于上述分析,本实验采用高氯酸一步提取法并补充正己烷脱脂步骤,在保证目标分析物回收率的前提下,有效去除主要干扰成分蛋白质和脂肪.改进提取方式,确保酸性提取环境既可使盐酸克伦特罗呈离子被有效提取,亦可使样品中蛋白质处于等电点以下,以完成蛋白变性,实现沉淀分离.
2.3 净化
吴林阳[7]、朱晓艾[8] 改进的方法省略了样品净化步骤,也取得了很好的回收率,但在实际检验中不加净化的样品进样会使假阳性概率会大大增加,因为在提取过程中与目标物盐酸克伦特罗性质相近的物质也会进入提取液中,高效液相色谱法对这些性质相近、出峰时间几乎相同的物质准确定性存在一定技术难度,甚至经常难以定性.应用固相萃取柱净化可有效去除这些干扰物质.
GB/T 5009.192-2003采用硅胶基弱阳离子交换柱,单纯利用盐酸克伦特罗在不同pH 条件下的带电特性实现纯化分离,效果较差,而且操作条件苛刻.本实验采用聚合物基质Cleanert PCX 混合型阳离子交换柱,具有强阳离子交换功能和反相色谱固定相的疏水作用的混合吸附剂,含有强酸性的磺酸功能基团,对碱性和中性化合物都能选择性地保留,可以提供反相和阳离子交换双重保留模式,这样目标物的回收率会更高,去除杂质的效果也会更好.
2.4 方法的线性范围
用1.4 制得的标准系列溶液,按照1.3 的仪器条件进样,以盐酸克伦特罗进样浓度（X）为横坐标,色谱峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线,见图2.工作站自动回归分析结果表明盐酸克伦特罗线性方程为Y等于134.504X+2.593,相关系数r等于0.999 4,线性范围：0.01 ～ 0.5 μg/mL.
2.5 精密度的测定
取0.3 μg/mL 盐酸克伦特罗标准工作溶液,平行进样5 次,检测到盐酸克伦特罗的峰面积分别为45.204、45.345、44.210、45.617、44.215 mAu·min,平均值为44.918 mAu·min,测定峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.47%.结果表明,该方法的精密度良好,能满足猪肉中盐酸克伦特罗的分析要求.
2.6 方法的加标回收率试验
取未检出目标物的猪肉空白样品10 g,加入1 mL0.3 μg/mL 标准工作液,制备盐酸克伦特罗浓度为30.0 μm/kg 的加标样品.按1.5 的前处理方法平行处理5 份样品,按照1.3 的仪器条件进样测试,检测结果分别为28.62、27.36、26.10、27.38、26.86 μm/kg,检测结果平均值为27.264 μm/kg,平均回收率为90.88%,精密度为3.37%,试验结果表明改进方法准确度高,可用于猪肉中盐酸克伦特罗的检测.
2.7 方法检出限
将盐酸克伦特罗标准溶液逐步稀释,并在相同色谱条件下对其进行测定,以各物质的色谱峰峰面积相当于基线噪声的3 倍信噪比为标准,计算检出限（S/N等于3）为0.45 μg/kg,与方法的检出限相当.国家标准GB/T 5009.192-2003 中规定的盐酸克伦特罗的定量限为0.5 μg /kg,本方法能够满足国家标准对克伦特罗的检测要求,且检出限更低.
3 结论
本实验建立了一种快速、简便、准确的猪肉中盐酸克伦特罗残留的高效液相色谱检测方法,线性范围为0.01 ～ 0.5 μg/mL,线性相关系数r等于0.999 4,峰面积RSD为1.47%,加标回收率达90.88%.流动相为0.02 mol/L 硫酸铵 + 甲醇 + 乙腈（体积比70 ∶ 25 ∶ 5）,检测波长210 nm.在此条件下,标准溶液目标峰峰形良好,出峰位置附近无杂质峰,有利于定性判定和定量计算；对猪肉样品盐酸克伦特罗检测的前处理方法进行了优化改进,采用高氯酸一步提取法并补充正己烷脱脂步骤,在保证目标分析物回收率前提下,有效去除主要干扰成分蛋白质和脂肪；应用混合阳离子交换柱净化提取液可进一步去除提取液中的碱性不溶物及与盐酸克伦特罗性质相近物质,避免假阳性结果并提高回收率.与GB/T 5009.192-2003 相比,目标物出峰时间合适,峰形良好,而且前处理过程简化,分析时间缩短,避免了操作难度较大的pH 值准确调节等步骤,适合于盐酸克伦特罗含量的快速、准确测定.
参考文献：
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作者简介：朱自平（1971—）,男,硕士,工程师；专业方向为食品安全检测.
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